يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لنشر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) باستخدام الوسائط المكيفة فقط المشتقة من المشيمة البشرية في طبق مغطى بالجيلاتين دون مكملات خارجية إضافية أو طبقات أساسية اصطناعية خاصة ب hPSC.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ثقافة نموذج رواية لالمحفزة الإنسان الجذعية نشر خلية على الجيلاتين في وسائل الإعلام مكيفة المشيمة-
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
< p class = 'jove_content'> كان انتشار الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) في وسط مكيف مشتق من الخلايا البشرية في ظروف الثقافة الخالية من المغذيات أمرا مثيرا للاهتمام. ومع ذلك، لم يتم تطوير طريقة مثالية للتكاثر بدون تغذية من الجسم الحي لمركبات السلفاسية النطاقية المرتفعة. حاليا ، تتم إضافة ركائز خارجية إضافية بما في ذلك عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) ، وهو عامل رئيسي للحفاظ على hPSC ، إلى جميع وسائط الاستزراع ويتم استخدام الطبقات السفلية الاصطناعية مثل Matrigel أو laminin في جميع الثقافات الخالية من المغذيات. في الآونة الأخيرة ، طورت مجموعتنا بروتوكولا بسيطا وفعالا لتكاثر hPSCs باستخدام وسائط مكيفة فقط مشتقة من المشيمة البشرية على طبق مغلف بالجيلاتين دون مكملات خارجية إضافية أو طبقات أساسية اصطناعية خاصة ب hPSCs. لم يتم الإبلاغ عن هذا البروتوكول من قبل وقد يمكن الباحثين من نشر hPSCs بكفاءة في ظروف الاستزراع المتوافقة مع البشر. بالإضافة إلى ذلك ، يتجنب هذا النموذج مخاطر تلوث hPSC بالمنتجات الحيوانية مثل الفيروسات أو البروتينات غير المعروفة. علاوة على ذلك ، يسهل هذا النظام الإنتاج الضخم السهل لمركبات PSC باستخدام طلاء الجيلاتين ، وهو سهل التعامل معه ، مما يقلل بشكل كبير من التكاليف الإجمالية لصيانة hPSC خارج الجسم الحي.
المقدمة
الهدف من هذا البروتوكول هو إكثار الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) في ظروف خالية من المغذيات خارج الجسم الحي المتوافقة مع البشر دون الحاجة إلى مكملات خارجية إضافية وركائز اصطناعية. حتى الآن ، كان تطوير نماذج ثقافة hPSC خارج الجسم الحي ، والتي تمكن من إدخال منتجات الاستزراع إلى العيادة ، مصدر قلق كبير في أبحاث الخلايا الجذعية. وعلى وجه التحديد، هناك مشكلتان حاسمتان بحاجة إلى معالجة. أولا ، هناك حاجة إلى نظام متوافق مع البشر خارج الجسم الحي لتكاثر hPSCs الذي يتجنب خطر التلوث بمنتجات الخلايا الحيوانية. ثانيا ، هناك حاجة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بيان الأخلاق: وقد أجريت الدراسة المشيمة البشرية مستقبلا، مع موافقة مجلس المراجعة المؤسسية للبحوث البشري من جامعة كوريا (AN09085-001). أجريت جميع التجارب في-جرثومة الحرة منشأة غرفة نظيفة في المركز الطبي لجامعة كوريا. تمت الموافقة على تصميم والإجراءات باستخدام hPSCs التجريبي من قبل مجلس المراجعة المؤسسية من المركز الطبي في جامعة كوريا (AN12277-003).
1. إعداد الآلات، الثقافة وسائل الإعلام، وأطباق
- معطف جميع الأطباق الثقافة بنسبة 0.1٪ الجيلاتين. المالحة الأوتوكلاف الفوسفات مخ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ومن مزايا هذه الطريقة نشر hPSC هو أنه يستخدم مكونات يفرز من خلايا الإنسان. والخطوة الأكثر ciritical في البروتوكول هو العزلة والثقافة من الخلايا المشتقة من المشيمة البشرية. وهذا يتطلب وتشريح دقيق من جزء محدد من HPC لوحة الزغب الشكل يظهر 1 إجراءات المستمدة من المشيمة البشرية العزلة الخلية. هذه العملية بسيطة ومريحة لعزل الخلايا، ويمكن أن تتم في غضون 1 ساعة. كما هو موضح في الشكل 2، والأنسجة تعلق على طبق وتشبه الخلايا الليفية الخلايا ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد تم تطوير هذا النموذج إلى نشر بنجاح hPSCs، مع الحفاظ على خصائصها، وأنسنة ظروف ثقافة خالية من التغذية بدون إضافة عوامل النمو المؤتلف خارجية مثل bFGF أو الأنسولين، مما يتيح التلاعب hPSCs في المكروية أنسنة. bFGF مكملات خارجي هو شائع وتطبيق الطبقات التحتية مثل Matrigel أو Laminin الحالي هو ضروري لتغذية خالية من زراعة من hPSCs 14.
هذا البروتوكول هو بسيط وسهل التنفيذ. ومع ذلك، بعض الخطوات الحاسمة لنجاحها........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وتشير المؤلفين جود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر قريبا تشيول كونج (MD، دكتوراه، أستاذ مشارك، قسم التوليد وأمراض النساء، جامعة كلية طب كوريا) لتوفير أنسجة المشيمة. وأيد هذا العمل في جزء من المنح (R1211902) من المؤسسة الوطنية للبحوث كوريا (جبهة الخلاص الوطني)، وجمهورية كوريا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شركة Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | Corporation M4287 | 10 & mu ؛ جم / مل |
| طقم الكشف عن الميكوبلازما | TaKaRa Bio Inc. | # 6601 | |
| Matrigel | BD Biosciences | # 354277 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies Inc. | # 05850 | |
| Dispase | Worthington Biochemical Corporation | LS02100 | 1 مجم / مل |
| الجيلاتين | Sigma-Aldrich Corporation | G2500 | 0.10٪ |
| BM-Cyclin | Roche | 799 050 | 10 & mu ؛ جم / مل |
| مجموعة صغيرة RNeasy | Qiagen | 74104 | |
| نانو إسقاط الطيف الضوئي | الحرارية فيشر Scientific Inc | ||
| iQ SYBR الأخضر qPCR ماستر ميكس | مختبرات Bio-Rad | # 170-8882AP | |
| ES مجموعة توصيف الخلايا | Chemicon International، Inc. ، | SCR001 | |
| Power cDNA Synthesis Kit ؛ | iNtRON التكنولوجيا الحيوية | 25011 | |
| QIAamp® مجموعة الحمض النووي الصغيرة | Qiagen | 56304 | |
| AmpF / STR & reg ؛ تحديد الهوية® طقم تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل | Applied Biosystems Inc. | 4322288 | |
| Applied Biosystems® 3130xl Genetic Analyzer | شركة Applied Biosystems Inc. |
المراجع
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Amit, M. C., Shakiri, V., Margulets, J. Itskovitz-Eldor Feeder layer and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Re....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
