本文介绍了一种基于负载药物蛋白模板原位合成超小荧光金纳米簇（Au NCs）的小分子药物筛选方案。该方法通过蛋白模板化金纳米簇发出的可见荧光信号，简便地测定药物与靶标蛋白之间的结合亲和力。
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本文内容
摘要
摘要
我们展示了一种新的药物筛选方法，该方法通过在载药蛋白中形成荧光金纳米簇（Au NCs），并基于Au NCs发射的差异性荧光信号，测定小分子药物与靶标蛋白之间的结合亲和力。选择人血清白蛋白（HSA）和牛血清白蛋白（BSA）作为模型蛋白，测试了四种对白蛋白具有不同结合亲和力的小分子药物（例如，布洛芬、华法林、苯妥英和磺胺酰胺）。研究发现，在变性条件（即，60 °C或存在尿素）下，载药白蛋白蛋白内部荧光Au NCs的形成速率比在未载药的原始蛋白中更慢。此外，所形成NCs的荧光强度与这些药物对白蛋白的结合亲和力呈负相关。特别是，药物-蛋白结合亲和力越高，Au NCs的形成速率越慢，因而所得Au NCs的荧光强度越低。因此，所得Au NCs的荧光强度可作为所测试不同药物相对结合强度的简单度量。通过在固定蛋白浓度下改变预载入蛋白中的药物含量，该方法还可扩展用于测定特定的药物-蛋白结合常数（KD）。所测得的结果与其他权威但更复杂方法获得的数值高度一致。
引言
血清白蛋白（如人血清白蛋白 HSA 和牛血清白蛋白 BSA）是血浆中最丰富的蛋白质，在维持血液 compartment 的渗透压方面起着至关重要的作用。它们也被公认为是水溶性较低的小分子（如类固醇、脂肪酸、甲状腺激素以及多种药物）的载体蛋白。这些分子与血清白蛋白的结合特性（例如，结合位点、结合亲和力或结合强度）是药代动力学研究中的一个重要课题。1-4 目前已开发出多种分析方法用于研究不同药物与血清白蛋白的结合特性，例如 X 射线晶体学5,6、核磁共振（NMR）7-11 和表面等离子体共振（SPR）12,13 等。然而，这些方法往往受限于繁琐且耗时的分析过程（例如，X 射线晶体学所需的单晶生长）、需要专用且昂贵的设备（SPR），或需使用昂贵的同位素标记（NMR）进行检测。因此，开发一种快速、直接且成本效益高的小分子药物筛选替代方法具有重要意义。
金纳米簇（Au NCs）是一类特殊的纳米材料，包含数个至数十个金属原子，尺寸小于2 nm14-17。由于其离散且尺寸依赖的电子结构18,19以及类分子的吸收和发射特性20-23，这类材料引起了广泛的研究兴趣。这些独特的材料性质，尤其是强荧光性，在生物体系中的传感与成像等方面已获得广泛应用24-32。超小荧光金纳米簇可通过功能性蛋....
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方案
警告：使用所有相关化学品前，请查阅其安全数据表（SDS）。药物筛选实验涉及纳米材料的合成与操作，其危害可能较块体材料更高。请确保在整个实验过程中采取所有必要的控制措施，包括使用工程控制设备（如通风橱）和个人防护装备（PPE，例如，长裤、不露脚趾的鞋、耐化学腐蚀手套和护目镜）。
1. 药物筛选用化学试剂的准备
- 合成金纳米簇的前体
- 将30 mg氯化金（III）溶液（痕量金属含量≥99.99%，30 wt.%溶于稀盐酸中）溶解于6.9 ml超纯水中，配制15 mM的氯化金（III）溶液。注意：氯化金溶液具有腐蚀性和刺激性，操作时应穿戴适当的个人防护装备，避免与眼睛和皮肤直接接触。
- 将74 mg HSA或BSA溶解于1 ml超纯水中，配制74 mg/ml的蛋白储备液。
- 药物溶液
- 将所需量的药物，例如，(a) 布洛芬1.9 mg、(b) 华法林2.8 mg、(c) 苯妥英2.3 mg、(d) 磺胺苯酰1.5 mg，分别溶解于20 µl DMSO中，配制450 mM的药物储备溶液。
注：选择DMSO作为溶剂是因为这些药物具有疏水性，在水中溶解度较差。
- 将所需量的药物，例如，(a) 布洛芬1.9 mg、(b) 华法林2.8 mg、(c) 苯妥英2.3 mg、(d) 磺胺苯酰1.5 mg，分别溶解于20 µl DMSO中，配制450 mM的药物储备溶液。
- 其他试剂
- 将600 mg氢氧化钠颗粒溶解于10 ml超纯水中，配制1.5 M....
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结果
蛋白质去折叠是形成蛋白质模板化金纳米簇（Au NCs）的重要步骤，因为蛋白质中更多的活性功能基团（例如，酪氨酸残基）得以暴露，从而还原被包埋的金离子，加速Au NCs的形成速率。加热和添加外部变性剂是促进蛋白质去折叠过程的两种常用方法。图1以人血清白蛋白（HSA）为模型蛋白，展示了加热和添加外部变性剂对Au NCs形成动力学的影响。首先通过测量光致发光光谱随时间的变化来研究加热对Au NCs形成动力学的影响（图1A和1B）。当反应在60 °C下进行时，可在较短时间内（100分钟）快速形成红色发射的Au NCs，这由光致发光光谱中在670 nm处逐渐增强的明显发射峰所证实33,36（图1B）。相比之下，在相同时间内于室温下进行的反应，在670 nm处未观察到Au NCs的发射峰（图1A）。
还通过使用牛血清白蛋白（BSA）作为模板、尿素作为变性剂，研究了引入外部变性剂对金纳米簇（Au NCs）形成动力学的影响。.......
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讨论
该方法中有若干关键步骤需要特别强调。在筛选不同小分子药物相对结合亲和力的实验方案中，步骤 3.1.2、3.1.3 和 3.1.4 对获得显示相对结合强度一致趋势的良好结果至关重要。在这些步骤中，添加试剂和抽取反应溶液进行检测的操作应尽可能迅速，以最小化时间延迟效应，同时应保持添加试剂和取样检测的顺序一致，以确保实验的可重复性。在测定布洛芬与人血清白蛋白（HSA）结合常数的实验方案中，步骤 3.2.4 对成功测定 KD 值极为重要。尽管可选择更多的浓度点，但因待测样品增多，时间延迟效应会更加显著。为最小化时间延迟效应，可在不同浓度下的反应体系合成可分批次平行进行。在每一批次中，均应包含一个不含药物的对照组，以确保实验一致性并消除可能的系统误差。
在本视频中，选择人血清白蛋白（HSA）作为模型蛋白，用于指导荧光金纳米簇（Au NCs）的合成，以进行药物筛选。仅使用了四种不同的药物， 即（a）布洛芬，（b）华法林，（c）苯妥英，以及（d）磺胺苯胺在此处被检测。事实上，该方法具有通用性，可被改造成多种形式。理论上，只要其他药物或小分子（如类固醇、脂肪.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Y.N.T. 感谢新加坡科技研究局（A*STAR）通过 JCO CDA 项目 13302FG063 提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30% 氯化金（III）溶液 | Sigma-Aldrich | 484385 | 腐蚀性，刺激性 |
| 人血清白蛋白，96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| 牛血清白蛋白，96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 布洛芬，98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| 华法林，98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| 苯妥英 | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| 磺胺，99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| 磁力搅拌器 | IKA | RT5 | |
| 酶标仪 | Tecan | Infinite M200 | |
| 384 孔板 | Corning | ||
| 5 ml 空气置换移液器 | Eppendorf | ||
| 1,000 μl 空气置换移液器 | Eppendorf | ||
| 100 μl 空气置换移液器 | Eppendorf | ||
| 5,000 μl Eppendorf 吸头 | |||
| 1,000 μl Eppendorf 吸头 | |||
| 100 μl Eppendorf 吸头 | |||
| 1.5 ml 微量离心管 | Eppendorf | ||
| 带螺口盖的 20 ml 玻璃小瓶 | |||
| 带螺口盖的 4 ml 玻璃小瓶 |
参考文献
- Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
- Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J.
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重印与许可
