Dieses Protokoll verwendet dreidimensionale (3D) Bildgebung und Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Die Techniken sind anwendbar auf andere Situationen, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um eine Teilmenge der Daten aus einem anderen Fluoreszenzsignal zu isolieren.
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Methodenartikel
Dreidimensionale Bildgebung und Analyse der Mitochondrien innerhalb von menschlichen Intraepidermal Nervenfasern
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Ziel dieses Protokolls ist, Mitochondrien innerhalb Intraepidermal Nervenfasern zu studieren. Daher wurden 3D Bildgebung und Analysetechniken entwickelt, um Nerv-spezifische Mitochondrien zu isolieren und Krankheit verursachten Veränderungen der Mitochondrien in der distalen Spitze der sensorischen Nerven zu bewerten. Das Protokoll verbindet Fluoreszenz Immunohistochemistry, konfokale Mikroskopie und 3D-Bild Analysetechniken zu visualisieren und Nerv-spezifische Mitochondrien zu quantifizieren. Detaillierte Parameter sind im gesamten Verfahren definiert, um ein konkretes Beispiel, wie man diese Techniken verwenden, um Nerv-spezifische Mitochondrien isolieren zu bieten. Antikörper wurden verwendet, um Nerven zu beschriften und mitochondriale Signale in Gewebeschnitten der Haut Punsch Biopsien, die folgte indirekte Immunfluoreszenz, Nerven und Mitochondrien mit grünen und roten Fluoreszenzsignal bzw. zu visualisieren. Z-Serie-Bilder wurden mit der konfokalen Mikroskopie erworben und 3D Analyse-Software wurde zur Verarbeitung und Analyse der Signale. Es ist nicht notwendig, die genauen Parameter innerhalb beschrieben folgen, aber es ist wichtig, die konsistent mit denen, die in der Färbung, Erfassung und Analyse Schritten gewählt werden. Die Stärke dieses Protokolls ist, dass es auf eine Vielzahl von Umständen anwendbar ist, wo ein Fluoreszenzsignal verwendet wird, um andere Signale zu isolieren, die sonst unmöglich, allein zu studieren.
Einleitung
Mitochondrien dienen wichtige Zellfunktionen, die Produktion von Zellenergie, Pufferung, Kalzium, und Regulierung der nekrotischen und Apoptotic Zelle Tod1,2,3enthalten. Das Nervensystem hat eine hohe metabolische Rate im Vergleich zu den Körper4 darauf hindeutet, dass Neuronen ein hohes Maß an zelluläre Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP erzeugen) durch mitochondriale Atmung. Eine Menge Beweise dokumentiert, dass neuronale Funktionen ATP5, vor allem bei den Synapsen6abhängig sind. Die Verteilun....
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Protokoll
Haut Stanzbiopsien stammen aus Themen, die von einem großen Community-basierte Erstversorgung Netzwerk an der University of Utah Diabeteszentrum (Salt Lake City, UT) rekrutiert wurden. Diese Studie wurde von der University of Michigan Institutional Review Board genehmigt und erfüllt mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki. Schriftliche Einwilligung eingeholt wurde, aus jedem Fach vor dem Test.
1. Fluoreszenz Immunohistochemistry
- Prepare Stanzbiopsien für Intraepidermal Nervenfaser Immunohistochemistry:
- Perform 3 mm Haut Biopsien durch medizinisches Personal und die gesamte Biopsie in 1,5 mL Zambon....
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Ergebnisse
Visualisierung und Quantifizierung der Mitochondrien innerhalb von menschlichen IENFs
Fluoreszenz Immunohistochemistry ermöglicht die gleichzeitige Kennzeichnung von mehreren Signalen innerhalb menschlicher Hautbiopsien, Nerven, Mitochondrien und Kerne zu visualisieren. Eine 96-Well-Platte ist eine komfortable Möglichkeit, die Schritte des Verfahrens Immunohistochemistry zu organisieren. Abb.......
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Diskussion
Dieses Protokoll soll zu isolieren, zu quantifizieren und zu analysieren, die Größe und Verteilung der Nerv-spezifische Mitochondrien innerhalb von IENFs in 3D aus Menschenhaut Biopsien. Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Die frei schwebenden Fluoreszenz Immunohistochemistry soll beflecken und mehrere Signale in jeder Probe, die eine vielseitigere Methodik für explorative Forschung44,45analysieren. Dieses Verfahren ermöglicht für die Penetration der .......
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Offenlegungen
Keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien K08 NS061039-01A2, The Program für Neurologie Forschung & Entdeckung und A. Alfred Taubman Medical Research Institute an der University of Michigan. Dabei verwendet die Morphologie und die Bild-Analyse-Kern des Michigan Diabetes Research Center, finanziert durch das National Institute of Health Grant 5P 90 DK-20572 vom National Institute of Diabetes und Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen. Die Autoren möchte J. Robinson Singleton und A. Gordon Smith (University of Utah) danken, für ihre großzügige Spende von menschlichen Hautproben.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2% Zamboni's Fixative | Newcomer Supply, Middleton, WI | 1459A | 2 % Paraformaldehyd, 0,2 % gesättigte Pikrinsäure in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 |
| 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP399-4 | Zur Herstellung von 1x PBS |
| Image-iT FX Signal Enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | I36933 | verbessert Alexa Fluor-Farbstoffsignale durch Reduzierung der unspezifischen Bindung |
| Anti-Protein Gene Product 9.5 Antikörper (Kaninchen polyklonal) | Proteintech Group Inc. Rosemont, IL | 14730-1-AP | abgekürzt als PGP9.5, ersetzt das abgekündigte AbD Serotec (Kat. Nr. 7863-0504) Antikörper |
| Anti-Pyruvat-Dehydrogenase E2/E3bp Antikörper (Maus monoklonal) | abcam, Cambridge, MA | ab110333 | abgekürzt als PDH |
| Ziege Anti-Maus Sekundärer Antikörper Alexa Fluor 594 Konjugat | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11034 | rot fluoreszierender konjugierter Sekundärantikörper |
| Ziege Anti-Kaninchen Sekundärer Antikörper Alexa Fluor 488 Konjugat | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | A-11032 | grün-fluoreszierender konjugierter Sekundärantikörper |
| Albumin, aus dem Rinderserum | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A7906-100 | abgekürzt als BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9284 | abgekürzt als TX-100 |
| 0,22 µ m Filter | EMD Millipore, Billerica MA | MILLEX GP SLGP 033NS | 0,22 µ m Millipore-Filter |
| Parafilm M | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 13-374-10 | Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996) |
| Nicht kalibrierte Schleife | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-032092 | Impfschleife von Decon LeLoop (MP 199-25) |
| 96-Well-Assay-Platte | Corning Incorporated, Corning, NY | 3603 | 96-Well-Platte mit flachem Boden |
| Prolong Gold Antifading-Reagenz mit DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | P-36931 | DAPI Färbung von Zellkernen |
| Mikroskop-Deckglas 50 x 24 mm | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-544E | Deckgläser |
| Superfrost Plus Objektträger | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 12-550-15 | Objektträger |
| Leica SP5 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL | SP5 | Konfokales Mikroskop |
| Volocity x64 Software | Perkin Elmer, Waltham , MA | Version 4.4.0 | Volocity-Software wird für die Schritte 3.1 und 3.2 im Protokoll für die Bildverarbeitung verwendet |
| Imaris x64 3-dimensionale Analysesoftware | Bitplane, Concord, MA | Version 7.7.1 | Imaris-Software wird für die Schritte 3.3 bis 3.5 im Protokoll für die Bildanalyse |
| verwendet Excel | Microsoft, Redmond, WA | Version Office 2013 | Die Excel-Tabellenkalkulationssoftware wird für Schritt 3.6 im Protokoll verwendet, um die morphometrischen Merkmale zusammenzufassen |
| Optimum Cutting Temperature Compound | Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA | 4583 | abgekürzt als OCT |
| Leica Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL | CM1850 | Kryostat zum Schneiden von 50 & Mikro; m Schnitte |
| CellLight Mitochondrien-GFP, BacMam 2.0 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts | C10600 | Wird als positive Kontrolle verwendet, um Mitochondrien mit einem grün fluoreszierenden Signal zu markieren |
Referenzen
- Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
- Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
- Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X.
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Nachdrucke und Genehmigungen
