Цель этого протокола заключается в демонстрации того, как контролировать флуоресцентно-меченого динамики белков на завод клеточной поверхности с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии, показывающие мигать точками GFP-тегами ПАТРУЛЬ 1, белка через мембрану, в клеточной коре устьичного комплекса в Резуховидка Таля.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В режиме реального времени изображений растений клеточной поверхности динамика с переменным углом эпифлуоресцентной микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клеточная поверхность растения является его интерфейсом для восприятия сигналов окружающей среды; она реагирует на биологические изменения клетки, такие как перенос мембран и перестройка цитоскелета. Анализ изображений таких внутриклеточных событий в режиме реального времени и с высоким разрешением улучшит понимание биологии растительных клеток на молекулярном уровне. Эпифлуоресцентная микроскопия с переменным углом наклона (VAEM) — это новый метод, который позволяет получать высококачественные покадровые изображения флуоресцентно меченых белков на поверхности растительных клеток. В данной статье описаны практические процедуры подготовки образцов VAEM, настройки оптической системы VAEM, видеосъемки и анализа изображений. В качестве примера наблюдения ВАЭМ представлены репрезентативные результаты по динамике PATROL1. Это белок, необходимый для движения устьиц, который, как полагают, участвует в доставке протонной помпы к плазматическим мембранам в устьичном комплексе Arabidopsis thaliana. Наблюдение VAEM в режиме реального времени за защитными клетками и вспомогательными клетками семядолей A. thaliana показало, что флуоресцентно помеченные PATROL1 проявлялись в виде точечных структур на плазматических мембранах в течение нескольких секунд, а затем исчезали. Кимографический анализ данных VAEM определил временное распределение присутствия (называемое «временем пребывания») точечных структур. Использование VAEM обсуждается в контексте данного примера.
Введение
Поверхность растительной клетки, включая плазматическую мембрану и непосредственно прилегающую к ней цитоплазму, является основной областью восприятия и интеграции растительными клетками биотических и абиотических сигналов из внеклеточной среды. В ответ на эти сигналы компоненты клеточной поверхности, включая белки плазматической мембраны и цитоскелет коры, претерпевают динамические изменения в масштабе от нескольких секунд до1-4 минут. Таким образом, визуализация флуоресцентных белков на поверхности клетки в режиме реального времени и с высоким разрешением может пролить свет на реакцию растения на сигналы окружающей среды на молекулярном уровне.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка рассады
- Стерилизовать семена.
- Приготовьте раствор стерилизации путем добавления 500 мкл NaClO (активного хлора: 5,0%) и 1 мкл 10% Triton X-100 до 500 мкл стерильной воды.
- Место около 10 трансгенных А. THALIANA семена, несущие GFP-ПАТРУЛЬ 1 8 в 1,5 мл трубки.
- Добавить 1 мл 70% раствора этанола и тщательно перемешать путем обращения в пять раз. Оставить на 1 мин.
- Заметим, семена опускаются на дно пробирки. В чистом шкафу с ламинарным потоком, осторожно удалите 70% этанола, используя микропипетку, и добавить 1 мл раствора стерилизации. Все хорошо перемешать путем обращения в пят....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом видео статьи, протоколы для VAEM наблюдения GFP-ПАТРУЛЬ 1 в А. THALIANA семядолей устьичных сложные клетки обеспечены. Небо падение монтаж простой способ получения, которые могут помочь уменьшить возникновение воздушных пузырьков в VAEM препаратов А. THALIANA семядоли (Рисунок 1). Слишком сильный лазера входа и / или г-позиционирования образцов для VAEM обеспечит нечетких снимков. Если это произойдет, то рекомендуется, чтобы начать снова с позиции непосредственно над образцом, с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом видео статьи, протоколы приведены для мониторинга и измерения динамических характеристик GFP-ПАТРУЛЬ 1 точек на устьичного комплекса Arabidopsis THALIANA. Как показано здесь, VAEM наблюдения является мощным инструментом для живых изображений клеток растений поверхностей. В условиях эксперимента, используемых здесь для контроля GFP-ПАТРУЛЬ 1, было очень мало флуоресценции фотообесцвечивание в образце, используемом в течение 1 мин захвата видео, потому что очень чувствительны EM-ПЗС позволяет использовать .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автор не имеет ничего раскрывать.
Благодарности
Я благодарен доктору Масару Фудзимото за его технические предложения по VAEM. Я также благодарен профессору Ко Иба и доктору Мими Хасимото-Сугимото за предоставление трансгенных растений GFP-PATROL1 и обсуждение PATROL1. Я благодарю профессора Сэйитиро Хаседзаву за его постоянную поддержку моей работы. Эта работа была поддержана грантом KAKENHI No 25711017 Японского общества содействия науке (JSPS).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Инвертированный микроскоп | Olympus | IX-73 | |
| TIRF Olympus | IX3-RFAEVAW | ||
| TIRF объектив | Olympus | UAPON 100 × ОТИРФ | NA = 1,49 |
| Блок управления углом лазера | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Полупроводниковый лазер с оптической накачкой | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510– Полосовой фильтр 550 нм | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD камера | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| Блок изменения увеличения камеры с креплением C | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph программное обеспечение | Molecular Devices | MetaMorph версия 7.7.11.0 | |
| TIRF микроскопия | инструкция Olympus | AX7385 | Инструкция: Система полного внутреннего отражения (Напечатано в Японии 24 августа 2012 г.) |
| Иммерсионное масло | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 градуса) |
Ссылки
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
- Fujimoto, M., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
