מערכת השראת השורש הרוחבי (LRIS) מאפשרת אינדוקציה סינכרונית של שורשים לרוחב ומוצגת עבור Arabidopsis thaliana ותירס.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מערכת עין מתנהל שורש לרוחב ב
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
התפתחות שורשים לרוחב תורמת משמעותית למערכת השורשים, ולכן היא חיונית לצמיחת הצמח. עם זאת, המחקר של התחלת שורש לרוחב הוא מייגע, מכיוון שהוא מתרחש רק בכמה תאים בתוך השורש ובאופן בלתי צפוי. כדי לעקוף בעיה זו, פותחה מערכת השראת שורש לרוחב (LRIS). על ידי טיפול בשתילים ברצף עם מעכב הובלת אוקסין ואוקסין סינתטי, התחלת שורש לרוחב מבוקרת מאוד מתרחשת באופן סינכרוני בשורש הראשוני, ומאפשרת דגימה בשפע של שלב התפתחותי רצוי. ה-LRIS פותח לראשונה עבור Arabidopsis thaliana, אך ניתן ליישם אותו גם על צמחים אחרים. בהתאם לכך, הוא הותאם לשימוש בתירס (Zea mays). ניתנת סקירה מפורטת של השלבים השונים של ה-LRIS בשני המפעלים. השילוב של מערכת זו עם טרנסקריפטומיקה השוואתית איפשר לזהות הומולוגים פונקציונליים של גנים להתחלת שורש לרוחב Arabidopsis במינים אחרים, כפי שמודגם כאן עבור CYCLIN B1; 1 (CYCB1; 1) גן מחזור התא בתירס. לבסוף, נדונים העקרונות שיש לקחת בחשבון בעת פיתוח LRIS עבור מיני צמחים אחרים.
מבוא
מערכת השורשים היא קריטית לצמיחת צמח, שכן הוא מבטיח מעגן וספיגה של מים וחומרים מזינים מהאדמה. בגלל ההתרחבות של מערכת שורשים בעיקר מסתמכת על הייצור של שורשים לרוחב, הייזום והקמה שלהם נחקרו בהרחבה. שורשים לרוחב הם יזמו בתת-קבוצה מסוימת של תאי pericycle, הנקראים תאי מייסד 1. ברוב dicots, כגון thaliana ארבידופסיס, תאים אלה נמצאים בקטבי protoxylem 2, ואילו בmonocots, כגון תירס, שהם נמצאים בקטבי השיפה 3. תאי מייסד מסומנים על ידי תגובת אוקסין עלה 4, ואחריו ביטוי של גני מחזור התא ספציפיים (למשל, cyclin B1; 1 / CYCB1; 1), לאחר שהם עוברים סיבוב ראשון של חטיבות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ארבידופסיס LRIS פרוטוקול
הערה: הטקסט מתייחס לניסויים בקנה מידה "קטנים" או "גדולים". ניסויים בקנה מידה קטנים, כגון ניתוח קו הסמן וצביעה היסטולוגית 6, 14, דורשים רק כמה דוגמאות. ניסויים בקנה מידה גדולים, כגון בזמן אמת כמותי qRT-PCR, מיקרו-מערכי 9-11 או רצף RNA, דורשים כמות גדולה יותר של דגימות. ככזה, סכום של ~ 1000 שתילים לדגימה שימש אל Vanneste et. 11 לבצע ניסוי microarray לאחר נתיחת קטע השורש.
יום 1
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
יישום של LRIS לבצע transcriptomics השוואתי של תהליך רוט ייזום הרוחב
אחד יישומים של LRIS הוא ההשוואה וההתאמה של פרופילי ביטוי גנים במהלך היווצרות שורש לרוחב במינים שונים. transcriptomics השוואתי גישות ליצור את האפשרות להצביע גני orthologous המעורבים בתהליך פיתוח השורש לרוחב במינים שונים. חניכה לרוחב שורש, אשר מורכבת מההיווצרות של אי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול ארבידופסיס LRIS, חשוב להעביר רק את השתילים שצמחו כולו במגע עם מדיום גידול רשות הטבע והגנים המכיל. הדבר מבטיח כי ייזום שורש לרוחב חסום על אורך השורש כל. כדי למנוע פציעת שתילי במהלך העברה, זרועות המלקחיים המעוקלים יכולות להיות מכור תחת הפסיגים של השתיל. עם ההעברה, לוודא כי שורשי השתיל נמצאים בקשר עם מספיק הבינוני אגר המכיל NAA. זו יכולה להיות מושגת על ידי רפרוף השורש על פני אגר על פני מרחק קטן. זה יבטיח אינדוקציה מסונכרנת יעילה של ייזום שורש לרוחב על סך אורך השורש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
יש המחברים אין לחשוף.
תודות
המחברים מודים לדייבי אופדנקר על הסיוע הטכני והצילום. אנו מודים מאוד לד"ר אניק בלייס על הצעות מועילות לשיפור כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי התוכנית הבין-אוניברסיטאית לקטבי משיכה IUAP P7/29 'MARS' מהמשרד הפדרלי למדיניות המדע בבלגיה, על ידי G027313N המענקים של FWO ועל ידי הסוכנות לחדשנות על ידי מדע וטכנולוגיה, IWT (IR).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ARABIDOPSIS LRIS | |||
| <זרעים>חזקים ארבידופסיס חזקים> | |||
| אקוטיפ | Col-0 | ||
| <חזק>עיקור גז של זרעים | |||
| 1.5 מ"ל | SIGMA-ALDRICH | 0030 125.215 | Eppendorf מיקרו-צינורות 3810X, |
| צינורות מיקרו-צנטריפוגה נקיים PCR 2 מ"ל | SIGMA-ALDRICH | 0030 120.094 | צינורות מיקרוצנטריפוגה Eppendorf Safe-Lock |
| חומצה הידרוכלורית | Merck KGaA | 1,003,171,000 | 37% (אדים) לניתוח EMSURE ACS,ISO,REAG. Ph Eu |
| מייבש זכוכית | SIGMA-ALDRICH | ||
| פלסטיק מיקרו-צנטריפוגה צינורות קופסה או מחזיק | |||
| <חזק>אקונומיקה עיקור זרעים | |||
| אתנול | Chem-Lab nv | CL00.0505.1000 | אתנול, abs. 100% a.r. מדלל ל-70% |
| נתרן היפוכלוריט (NaOCl) | Carl Roth | 9062.3 | 12% |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | |
| מים | |||
| <חזק>מדיום גידול | |||
| תערובת מלח Murashige ו-Skoog | DUCHEFA Biochemie B.V. | M0221-0050 | |
| אינוזיטול | SIGMA-ALDRICH | I5125-100G | |
| 2-(N-מורפולינו)חומצה אתנסולפונית (MES) | DUCHEFA Biochemie B.V. | M1503.0100 | |
| סוכרוז | VWR, Internation LLC | 27483.294 | D(+)-סוכרוז Ph. Eur. |
| KOH | Merck KGaA | 1050211000 | כדורים לניתוח (מקסימום 0.002% Na) EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur |
| תרבית רקמות צמחים Agar | LabM Limited | MC029 | |
| <חזק>כימיקלים אינדוקציה שורש לרוחב | |||
| N-1-חומצה נפתילפתלמי (NPA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | מס' N0926.0250 | 10 ומיקרו; M (Arabidopsis) |
| 1-חומצה אצטית נפתלין (NAA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | מס' N0903.0050 | 10 ומיקרו; M (Arabidopsis) |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | SIGMA-ALDRICH | 494429-1L | |
| <חזק>יצירת רשת להעברה | |||
| רשת ניילון | Prosep byba | רשת ניילון סינטטית 20 ומיקרו; m | |
| <חזק>זריעה וטיפול בשתילים | |||
| מרובעות | GOSSELIN | BP124-05 | 12 x 12 ס"מ |
| 50 מ"ל צינורות דוראן | SIGMA-ALDRICH | CLS430304 | קורנינג 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה |
| דריגלסקי | קארל רוט | K732.1 | |
| קצות פיפטה חתוכים | Daslab | 162001X | Universal 200, חתכו 5 מ"מ מהקצה לפני חיטוי |
| סרט נושם | 3M Deutschland GmbH | מס' 1530-1 | |
| פינצטה | Fiers nv/sa | K342.1; פינצטה K344.1 | דומונט מסוג A מס' 5; פינצטה דומונט סוג e מס' 7 |
| <תנאי גידול חזקים> | |||
| חדר | 21 ° C, רציף קל | ||
| <חזק>חומרים | <חזק>חברה | <חזק>קטלוג | <חזק>הערות |
| ><חזק>תירס LRIS | |||
| <חזק>זרעים<> | |||
| חזקיםגרעיני | B-73 | ||
| <עיקור חזק>אקונומיקה של גרעינים זכוכית חזקה> | |||
| Fiers nv/sa | C267.1 | ||
| נתרן היפוכלוריט (NaOCl) | קארל רות' | 9062.3 | 12% |
| מים | |||
| <חזקים>כימיקלים לאינדוקציה שורש לרוחב | |||
| N-1-חומצה נפתילפתלמי (NPA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | מס' N0926.0250 | 50 ומיקרו; M (שורש ראשוני של תירס), 25 ומיקרו; M (שורש תירס הרפתקני) |
| 1-נפתלין חומצה אצטית (NAA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | מס' N0903.0050 | 50 ומיקרו; M (תירס) |
| דימתילסולפוקסיד (DMSO) | SIGMA-ALDRICH | 494429-1L | |
| <חזק>זריעה וטיפול בשתילים | |||
| נייר מגבות ידיים | Kimberly-Clark Professional* | 6681 | SCOTT מגבות ידיים - גליל / לבן; גודל גיליון (24X46 ס"מ) |
| נייר נביטת זרעים | חברת | 10 X 15 38# נייר נביטת זרעים | |
| פינצטה | Fiers nv/sa | K342.1; פינצטה K344.1 | דומונט מסוג A מס' 5; פינצטה מסוג E מס' 7 |
| צינורות 250 מ"ל (צנטריפוגה) | SCHOTT DURAN | 2160136 | בקוטר של כ-5.6 ס"מ ובגובה 14.7 ס"מ |
| צינורות 700 מ"ל | DURAN GROUP | 213994609 | צילינדרים, צינור רגל עגול, D 60 x 250 |
| מתלה | לצינורות תירס, | ||
| סטריליים | |||
| <>תנאי גידול חזקים | |||
| ארון | 27 ° C, אור רציף, 70% לחות יחסית |
מקורות
- Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation. Development. 140, 4301-4310 (2013).
- Dolan, L., et al. Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
