العزلة و<em&gt; السابقين فيفو</em&gt; ثقافة Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; خلايا T γδ، وهو Extrathymic αβT خلايا السلف

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا محسنا لعزل واستنساخ كيان الخلايا التائية النادر للخلايا التائية المحيطية Vδ1 ⁺ CD4 ⁺ ، أي ، كما أظهرنا مؤخرا ، سلف للخلايا التائية αβ خارج الصعون. تسمح هذه التقنية بعزل هذه الخلايا واستنساخها وتوسيعها بكفاءة في ثقافة خارج الجسم الحي.

الملخص

الغدة الصعترية، الجهاز الرئيسي لتوليد αβ T الخلايا والعمود الفقري للنظام المناعي التكيفي في الفقاريات، منذ فترة طويلة تعتبر المصدر الوحيد للخلايا αβT. ومع ذلك، وارتداد الغدة الصعترية يبدأ في وقت مبكر في الحياة مما يؤدي إلى انخفاض شديد في انتاج الخلايا αβT ساذجة في الهامش. ومع ذلك، يمكن حتى المعمرين بناء مناعة ضد مسببات الأمراض المكتسبة حديثا. تشير الأبحاث الحديثة إلى تطوير خلية αβT extrathymic، لكن فهمنا للمسارات التي يمكن أن تعوض عن فقدان الغدة الصعترية وظيفة لا تزال اولى. خلايا T γδ هي الخلايا الليمفاوية الفطرية التي تشكل فرعية T-الخلية الرئيسية في الأنسجة. نحن المسند في الآونة الأخيرة وظيفة العالقة حتى تأخذ حقها من الآن إلى γδ الخلايا التائية فرعية من خلال إظهار أن الكيان نادرة من CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ خلايا T يمكن أن تحورها إلى خلايا αβT في حالات الالتهابات. هنا، نحن صrovide بروتوكول لعزل هذه السلف من الدم المحيطي وزراعته لاحقة. يتم إثراء خلايا Vδ1 إيجابيا من PBMCs من المانحين البشرية السليمة باستخدام حبات مغناطيسية، تليها الخطوة الثانية التي نحن فيها استهداف جزء نادرة من CD4 ⁺ الخلايا مع مزيد من تقنية وضع العلامات المغناطيسية. القوة المغناطيسية لوضع العلامات الثاني تجاوز واحدة من التسمية المغناطيسية الأولى، وبالتالي تسمح للعزلة إيجابية فعالة، والكمية المحددة للسكان الفائدة. نحن ثم إدخال هذه التقنية والثقافة الشرط المطلوب لاستنساخ وكفاءة توسيع الخلايا والتعرف على الحيوانات المستنسخة الناتجة عن تحليل FACS. وهكذا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لتنقية والثقافة وفيفو السابقين توسيع CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ γδ خلايا T. هذه المعرفة هي شرط أساسي للدراسات التي تتصل هذا αβT progenitor`s خلية البيولوجيا وبالنسبة لأولئك الذين يهدفون إلى بيئة تطوير متكاملةntify مشغلات الجزيئية التي تشارك في transdifferentiation لها.

المقدمة

في الفقاريات، والحصانة التكيفية التي يتمحور في الخلوية وجزء الخلطية الحصانة تلعب دورا رئيسيا في الدفاع ضد مسببات الأمراض. وتوسط الاعتراف مجموعة واسعة من مولدات المضادات التي كتبها T- hyperpolymorphic وB مستقبلات الخلايا (TCR / BCR)، الذي فيما يتعلق خلايا T يفترض أن تنتج بشكل رئيسي في الغدة الصعترية ^1. بذلك، الجذعية الخلايا المكونة للدم (HSCs)، المشتقة من نخاع العظام، والبذور الغدة الصعترية والتفريق على مراحل محددة جيدا يعطي في النهاية إلى ظهور كل الأنساب الخلايا التائية. الغدة الصعترية الأسلاف بذر هي CD4 ^- وCD8 ^- وبالتالي تشكل غير ناضجة، النفي المزدوج (DN) خلية توتية الكسر. إشارات التوتة المشتقة....

البروتوكول

بيان أخلاقيات: تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في جامعة توبنغن (المشاريع 38 / 2009B02 و 470 / 2013B02).

1. عزل خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs)

1. خذ 50-100 مل من المتطوعين الأصحاء عن طريق بزل الوريد باستخدام حقنة 50 مل تحتوي على 1000 وحدة دولية الهيبارين كبريتات وتمييع الدم 1: 2 مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.2).
2. طبقة بعناية 35 مل من الدم: حل PBS على ح....

النتائج

الشكل 1 يصور المراحل المختلفة ونتائج عزل الخلايا Vδ1 T من الدم المحيطي. ويبين الشكل 1A توزيع نموذجي من Vδ1 ⁺ الخلايا في CD3 ⁺ الخلايا الليمفاوية، فضلا عن التعبير شارك في مستقبلات السكان Vδ1 ^+. في هذا المانحة، وتواتر Vδ1 خلايا ⁺ (الأحمر) هو 2.3٪ من إجمالي تعداد اللمفاويات والتعبير CD4 (الأخضر) من Vδ1 ⁺ الخلايا الليمفاوية هو 2.6٪. وإجمالا، فإن السكان المستهدفين لعزل يمثل 0.06٪ م.......

المناقشة

لدراسة النمط الظاهري والبيولوجيا وظيفة من ندرة (T-) كيان الخلية، وهي خلايا CD4 ⁺ Vδ1 ⁺ T، استخدمنا اثنين علامات: Vδ1 وCD4 لعزل الخلايا المغناطيسية الإيجابية. Vδ1 هو مستقبل الأيتام، في حين يتم التعبير عن CD4 على الخلايا التائية المساعدة، على مستوى أدنى في وحيدات الخلايا الجذعية، وعلى مستوى منخفض جدا على الخلايا المكونة للدم السلف.

وتشمل التقنيات لإثراء واختيار من الخلايا في نقاء عالية مضان تن.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Biocoll Solution	Biochrom	L 6113	محلول فصل الخلايا الليمفاوية
Lysing Buffer	BD BioSciences	555899	تحلل كريات الدم الحمراء   ؛
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	Sigma Aldrich	D8537   ؛
مكمل MACS العازلة	Miltenyi Biotec	130-091-222	مع BSA والتبريد المسبق قبل الاستخدام
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376	ليس إلزاميا من هذا المورد
المضاد للإنسان Vd1 FITC (استنساخ:  TS8.2)	Thermo Scientific	TCR2730	ليس إلزاميا من هذا المورد
CD3 PerCP المضاد للإنسان (استنساخ: SK7) BD	BioSciences		345766 ليس إلزاميا من هذا المورد أو هذا
TCRab PE المضاد للإنسان (استنساخ: T10B9.1A-31) BD	BioSciences	555548 ليس	إلزاميا من هذا المورد أو هذا الفلوروكروم
المضاد للإنسان CD4 VioBlue (استنساخ: M-T466)   ؛	Miltenyi Biotec	130-097-333	ليس إلزاميا من هذا المورد أو هذا الفلوروكروم
المضاد للإنسان CD8 APC-H7 (استنساخ: SK1) BD	BioSciences	641400	ليس إلزاميا من هذا المورد أو مجموعة Flrochrome
Anti-FITC MultiSort	Miltenyi Biotec	130-058-701	تعطي نتائج أفضل من أعمدة MicroBeads MS المضادة ل FITC
Miltenyi Biotec		130-042-201	قم بتبريده مسبقا قبل الاستخدام
فاصل MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102
CD4 تقنيات الحياة لمجموعة العزل الإيجابي		11331D

Kit