Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон

12.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53551

⸱

23 декабря 2015 г.

 , 
1Center for Genetic Medicine, Northwestern University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол использует электропорацию для введения и экспрессии флуоресцентно меченых белков в мышечных волокнах мыши. После восстановления после электропорации волокна изолируются. Затем отдельные волокна визуализируются с помощью конфокальной микроскопии с высоким разрешением для визуализации структуры мышц.

Аннотация

Зрелая мышца имеет уникальную структуру, которая поддается визуализации живых клеток. В данной работе мы описываем экспериментальный протокол экспрессии флуоресцентно меченых белков в мышце flexor digitorum brevis (FDB). Условия были оптимизированы для обеспечения большого количества высококачественных миоволокон, экспрессирующих электропорированную плазмиду при минимизации повреждения мышц. В методе используются флуоресцентные метки на различных белках. Сочетание этого метода экспрессии с конфокальной микроскопией с высоким разрешением позволяет визуализировать живые клетки, в том числе после повреждения, вызванного лазером. Флуоресцентные красители в сочетании с визуализацией флуоресцентно помеченных белков предоставляют информацию об основной структуре мышц и их реакции на раздражители.

Введение

Отдельные мышечные волокна большие, высоко организованные синцитиальный клетки. Есть несколько моделей клеточных культур для мышц; Однако, эти модели имеют в качестве основного ограничения, что они полностью не дифференцируются в зрелые мышечные волокна. Например, клеточные линии C2C12 и L6 получены из мышей и крыс, соответственно 1-4. В условиях сывороточного голодания, мононуклеарные "миобластов, как" клетки перестают пролиферацию, пройти выходе клеточного цикла, и введите в программу, сформировав миогенной многоядерные клетки с саркомеров, называют мышечные трубки. При длительном условиях культивирования, мышечные трубки могут проявлять свойства сократительных и "дергаться" в культуре. Линии клеток человека также теперь установлено 5. В дополнение к этим линии иммортализованных клеток, мононуклеарных миобласты могут быть выделены из мышцы и под аналогичных условиях сывороточного голодания будет образовывать мышечные трубки. Эти клеточные линии и первичные культуры миобластов сильно использоватьFUL, потому что они могут быть трансфицированы плазмидами или вирусами, трансдуцированных и используется для изучения биологических процессов основной ячейки. Тем не менее, эти клетки, даже когда индуцированное с образованием мышечных трубках, лишены многих характерных особенностей зрелой организации мышцы. В частности, мышечные трубки намного меньше, чем отдельных мышечных волокон и зрелых хватает нормальной формы мышечных волокон. Критически, мышечные трубки не хватает поперечные (Т) канальцы, перепончатый сети необходимы для эффективной Са 2+ выпуска по всему myoplasm.

Альтернативный метод первичной миобластов или миогенных клеточных линий влечет за собой использование зрелых мышечные волокна. Трансгенез могут быть использованы для установления экспрессии меченных белков, но этот метод является дорогостоящим и трудоемким. В естественных электропорации мышцы мыши стала предпочтительным способом для его скорость и надежность 6-10.

Методы электропорации в естественных условиях и эффективного выделения миофибрилл гаве были оптимизированы для мыши сгибатель пальцев Brevis (FDB) мышцы 6. Эти методы могут быть завершены легко и малоинвазивная, чтобы вызвать в естественных условиях выражения из плазмид. Этот подход в настоящее время в сочетании с методами визуализации с высоким разрешением, включая изображения после лазерной нарушения сарколеммы 6,7. Сочетание флуоресцентных красителей и экспрессии белков флуоресцентно меченных может быть использован для мониторинга биологических процессов клеток в зрелые мышечные волокна.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Методы в этом исследовании были выполнены в соответствии с этической Северо-Западном университете Фейнберг школы медицины Институциональные животных уходу и использованию комитета (IACUC) утверждены методические рекомендации. Все усилия были сделаны, чтобы минимизировать страдания.

1. Методика эксперимента для в естественных условиях электропорации сгибателя Brevis (FDB) мышечный пучок в мышь

  1. Дизайн плазмиды для экспрессии в естественных условиях, используя промотор, известный выразить в клетках млекопитающих (например, цитомегаловирус, ЦМВ) или в мышцах (например, мышцы Креатинкиназа, МСК) 6,7. Большие плазмиды могут выразить на более низких уровнях. ЦМВ промоутер широко используется 6,7.
  2. Очищают плазмиды из E. палочка с помощью эндотоксинов условия за инструкциями изготовителя. Растворите плазмиды в стерильной, эндотоксинов ТЕ-буфера при температуре 2 - 5 мкг плазмиды / мкл.
  3. Развести и Алиготе плазмиды в concentratioп 20 мкг ДНК в 10 мкл стерильной эндотоксинов ТЕ (2 мкг / мкл) буфера на инъекцию в стерильный микроцентрифужных трубки. Подготовьте аликвоту за инъекции.
  4. Развести запас гиалуронидазы до 1х стерильным фосфатно-буферным раствором без кальция и магния (PBS - / -) дает конечную концентрацию 8 единиц. Алиготе 10 мкл разбавленного гиалуронидазы на инъекцию в стерильной микроцентрифужных трубки.
  5. Обезболить мыши, используя 2,5% изофлуран, пока не седативные и реагирует на хвост или ноги щипать. Поместите животное в положении лежа на спине на грелку или нагрева для поддержания таблицы нормальную температуру тела.
  6. Очистите подушечку мыши с переменным применения скраба повидон йода и спирта в три раза, используя подготовительную технику, происходящих с сайта иглы и излучающий наружу. Этот метод поддерживает сайт иглы в асептических условиях, минимизируя патогена введение.
  7. Внедрить пяте гое мышь с 10 мкл раствора гиалуронидазы 1x (2 мг / мл = 8 единиц) между кожей и мышцей, используя стерильный шприц 1 мл. Гиалуронидазу переваривает компоненты внеклеточного матрикса, чтобы позволить более эффективно ввод плазмиды в миофибрилл. Ввод в основании пятки и продвигать иглу в сторону пальцами. Медленно отпустите жидкость, как игла втягивается. Инъекции под кожу будет расширяться и начать розовеют.
  8. Повторите шаги 1.6 и 1.7 на противоположной ноге.
  9. Отключите анестезии и место мыши обратно в клетку. Разрешить мыши, чтобы полностью восстановиться от анестезии.
  10. Подождите 2 ч.
  11. Повторите процедуры стерилизации обезболивающие и ног, шаги 1.5 и 1.6.
  12. Вводят разбавленную плазмидной ДНК в подушечку лапы таким же образом, как гиалуронидазы. Убедитесь, что максимальный объем составляет 20 мкл или менее. Для экспрессии плазмиды вводят двойной 20 мкг каждой плазмиды с максимальным объемом 20 &# 181; л или менее.
  13. Повторите инъекции плазмиды на противоположной подушечку или использовать контралатеральной ногой управления инъекций.
  14. На ноге, что изначально впрыскиваемого, снять кожу от подчеркивание мышцы с тонким пинцетом и поместить одну 27 г иглу через кожу шаров вблизи пальцами в положении, перпендикулярном лечить-носок линии стопы. Возьмите вторую стерильную иглу 27 G и поместите его горизонтально через кожу в пятки. Место иглы параллельно друг другу ~ 1 см друг от друга.
  15. Использование крокодил зажимы, зажимные электроды к параллельному игл убедившись, что иглы не контактируют друг с другом. Использование пластилина можно закрепить зажимы на месте.
  16. Подключите электроды к электрическим стимулятором.
  17. Электропорации мышцы путем применения 20 импульсов, 20 мс в продолжительности / каждая, на 1 Гц, 100 В / см. Пальцы могут дергаться при стимуляции.
  18. Повторите процедуру стимуляции на противоположной ноге, если требуется.
  19. Удалить иглы. Протрите подушечку с повидон йода скраба.
  20. Выключите анестезии. Верните мышь в клетке восстановления и монитора активности. Если процедура была проведена, как и ожидалось, животное должно вернуть нормальную ходьбу в течение 30 мин и не проявляют никакой разницы в Ambulation или уровня активности от поведения предварительного впрыска. Таким образом, нет после процедуры анальгетики не требуется. После восстановления, вернуть животное в виварии.
    Примечание: Экспрессию белка могут быть проанализированы уже через 48 часов после электропорации. Тем не менее, чтобы обеспечить более полное восстановление после электропорации, мы предпочитаем изоляцию и изучение мышечных волокон 7 - 14 дней после электропорации 10. Выражение может быть проанализирована до тех пор, через 4 недели после электропорации.

2. Экспериментальная методика для изоляции сгибателя Brevis (FDB) волокон

  1. Оттепель коллагеназы. Для каждого FDB расслоения подготовить две скважины в культуре ткани пластины 12-а. В одном хорошо добавить 1 мл подогретого модифицированной Игла медиа Дульбекко плюс бычьего сывороточного альбумина (BSA DMEM +), а в другом хорошо добавить 1 мл подогретого раствора Рингера. Кроме того, добавить свежие 10 мл 1x Рингера раствора 35 мм Sylgard блюдо.
  2. Жертвоприношение животного через CO 2 или анестезирующего газа ингаляции, с последующим смещением шейных позвонков или другим способом, чтобы обеспечить смерть.
  3. Снимите задние ноги выше голеностопного сустава с помощью чистой лезвие бритвы и погрузите в раствор Рингера 1x в 35 мм Sylgard блюдо.
  4. Вывод один фут плотно, единственным вверх, на блюдо Sylgard с 30 г хвои через каждый из 5 советов ног и на лодыжке.
  5. Начиная с лодыжки, отрезать кожу прямо в стороне стопы вдоль линии роста волос к пальцами, осторожно, не повреждая мышцы под кожей. Повторите с другой стороны стопы.
  6. Проведение кожу у основания лодыжки с тонким пинцетом, порезать кожу через пятки.
  7. Подъем кожилоскут щипцами, указать свои ножницы к коже, чтобы не ник мышцы. СНиП основной соединительной ткани, эффективно удаляя кожу.
  8. Для удаления мышцы расслоение FDB сократить большое сухожилие в пятке, чтобы освободить сухожилия от кости. Проведение сухожилия пинцетом, рассекать связку FDB с большой белой сухожилия тщательно удаляя любые соединительной ткани, прикрепленный к FDB с ножницами. Если все сделано правильно расслоение легко снимите из основных сухожилий, раскрывающих яркие белые сухожилия, ведущие к отдельным цифр. Вырезать FDB на сухожилия возле пальцев, освобождая сверток из стопы.
  9. Поместите всю связку мышц в лунку, содержащую DMEM + BSA.
  10. Повторите на противоположной ноге.
  11. После того, как все мышцы FDB изолированы, добавить 100 мкл коллагеназа в каждую лунку, содержащую DMEM + BSA и мышцы.
  12. Проверьте успех электропорации на перевернутой флуоресцентного микроскопа до пищеварения. Если все сделано properlY, вверх 90% эффективности трансфекции может быть достигнуто.
  13. Инкубируйте планшет в увлажненной 37 ° C инкубаторе при 10% CO 2 в течение приблизительно 1 ч. Инкубационный период может меняться в зависимости от модели болезни и фона и много коллагеназы.
  14. После 1 часа, тщательно передачи Ассортимент FDB в лунку, содержащую только решения Рингера.
  15. Растирают пучок FDB в скважине с раствором Рингера с использованием 1 мл пипетки. Сокращение конец наконечника пипетки с чистым лезвием бритвы такова, что пучок может легко проходить через кончика пипетки. Аккуратно растирать мышцы (~ 15 раз), что позволяет расслоение пройти вверх и вниз параллельно к кончику. Интактные волокна будут падать в Ringers решения. Когда волокна не легко упасть сверток, поместите обратно в мышцы раствора коллагеназы.
  16. Пластина изолированных волокон на блюдо ~ 500 мкл на пластины.
  17. Разрешить мышцы усваивается в скважине в течение 15 мин.
  18. Повторите шаги 2.152,17 до расслоение не уменьшается в размере и большинство волокон диссоциируют из пучка (обычно в общей сложности в 2-3 раза). После того, как в отрыве мышцы легко проходит через кончика пипетки 1 мл.
  19. Пусть волокна придают блюду в течение как минимум 15 мин. Раствор Рингера Свежий могут быть добавлены к пластине, чтобы разбавить остаточного коллагеназы или изменена в зависимости от временных ограничений.
    Примечание: Волокна теперь готовы для работы с изображениями.

3. Экспериментальная методика для визуализации лазерно-индуцированной мембраны ущерб, используя конфокальной микроскопии

  1. Загрузка волокна непосредственно до визуализации с 300 мкл 2,5 мкМ FM 1-43 из FM 4-64 красителя в растворе Рингера. Как правило, изображения волокна 15 мин до 2 ч после выделения. Тем не менее, волокна могут быть отображены до после выделения 24 ч.
  2. Поместите нижнюю тарелку стекла на конфокальной микроскопии, оснащенной УФ-лазера и цели 60X / 63X.
  3. Найдите волокна. Убедитесь, что волокна прочно прикрепленна блюдо, нажав микроскопа базу. Исключить волокна, которые были повреждены в процессе диссоциации. Поврежденные волокна могут содержать мембранные волдыри, поглощение высоких уровней FM покрасить, завить или согнуть интенсивно.
  4. Для индукции повреждения мембраны на волокна, положение сарколеммы в центре окна визуализации с полем прозрачного ядер. Сосредоточьтесь на сарколеммы с использованием канала красителя FM, так что сарколеммы чрезвычайно острым.
  5. Поместите поперечный ROI волосы на сарколеммы использованием ЧМ 4-64 канал.
  6. Облучают точку 1 пиксель на 80% мощности в течение 3 сек (~ 350 нм х 350 нм) область. FM-краска будет проникать в клетку в месте травмы. Мощность и время можно отрегулировать, чтобы увеличить или уменьшить площадь инсульта.
  7. Захват изображения волокна, прежде чем ущерб, в момент повреждения, каждые 2 сек пост-ущерба, то каждые 10 сек до 5 мин. Сроки могут быть скорректированы в зависимости от необходимости. Отдельные изображения могут быть преобразованы в покадровой фильмов в Image J.
  8. Повторите шаги3.3 через 3,7 на 3-х волокон на блюдо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Электропорация является минимально инвазивной техники, эффективно вводит плазмидной ДНК в сгибатель пальцев Brevis (FDB) мышцы расслоения (рис 1А). Семь дней после трансфекции флуоресцентно меченый белок визуализируется в изолированных мышечных волокон (рис 1B). Изолированные волокна затем помещали и подготовлены для работы с изображениями на конфокальной микроскопии. Волокна могут быть подвергнуты лазерной индуцированной травмы. FM-краситель может быть ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование электропорации для изучения флуоресцентно меченных белков в естественных условиях идеально подходит для изучения данного мышцы отсутствие подходящих моделей линии клеток, которые точно повторяют всю структуру клеток мышц. Этот протокол описывает использование электропорации и высоким разрешением конфокальной микроскопии, чтобы представить подробную съемку локализации белка и транслокации после лазерной ранения. Этот метод может быть адаптирован для изучения других клеточных процессов, включая цито...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Там нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здоровья дает NS047726, NS072027 и AR052646.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMLife Technologies11995-073Среда для рассечения
Разведение: 50 мл +100 г BSA
Коллагеназа, тип IILife Technologies17101-015Разложение клетчатки
: 160 мг / 4 мл DMEM (бульон 40 мг/мл аликвоты)
Falcon 12-луночные блюдаFisher Scientific877229Fiber
Digestion Ringers SolutionПереваривание и визуализация клетчатки
разбавление: 146 мМ NaCl
5 мМ/нбл;   KCl
2 мМ    CaCl2
1 мМ    MCl2
10 мМ HEPES
pH7.4 in H2O
1 мл ПипеткиAxygenT-1000-C-R
Бритвенные лезвияPersonna94-120-71Прецизионная сглаживание для пищеварения
30 G иглаBD Biosciences305128Dissection
1x PBS (-/-)Life Technologies14190-250Диссекция
Sylgard 184Fisher Scientific50-366-794Щипцы для рассечения
FST от Dumont#5/45Щипцы для рассечения
RobozRS-4913Ножницы для пресечения
World Precision Instruments500260Диссекция
BSASigmaA7906Среда для рассечения
Разведение: 100 мг/50 мл DMEM
Falcon 60 мм посудаFisher Scientific08772BDissection - используется для удержания
электропорации
 Траваs88xЭлектропорационные
зажимыРадио Шака270-356Электропорация
ТриадинаАпликаре82-220Электропорация
Прецизионная глайд 27 G иглаBD Biosciences305136Симулятор электропорации
ТраваSIU-VЭлектропорация
МарляCovidien2146Электропорация
ГиалуронидазаSigmaH4272для инъекций
разведение: добавьте 160 мкл PBS (1x) к 40 &; l 5x стоковый
1 мл Инсулиновый шприц U-100 (28G1/2) BD Biosciences329420Инъекция
Eppendorf TubesFisher Scientific02-682-550Инъекция
35 мм стеклянное дно Микролуночная чашкаMaTekP35G-1,5-14-CМикроскопия
FM 4-64Life TechnologiesT-13320Микроскопия
Разведение: Final 2,5 мкг/мл
FM 1-43Life TechnologiesT-35356Микроскопия< br/> Разведение: Final 2,5 мкг/мл
Maxi Kit Endotoxinfree Plasmid KitQiagen12362Очистка плазмид
для пищеварения стимулятора sylgard

Ссылки

  1. Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
  2. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
  3. Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
  4. Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
  5. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34(2011).
  6. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
  7. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
  8. Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
  9. Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
  10. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
  11. Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
  12. Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
  13. Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
  14. Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
  15. Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
  16. Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Изоляция мышечных волоконконфокальная микроскопияколлагеназное перевариваниефлуоресцентное мечениелазерное повреждениекороткий сгибатель пальцеввизуализация сарколеммывизуализация живых клетокподготовка мышечных волокон
ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.