DNA电穿孔、肌纤维的分离与成像

摘要

本方案利用电穿孔技术将荧光标记的蛋白质导入小鼠肌纤维并使其表达。电穿孔后经恢复，分离肌纤维。随后使用高分辨率共聚焦显微镜对单根纤维进行成像，以观察肌肉结构。

摘要

成熟的肌肉具有独特的结构，适合进行活细胞成像。本文描述了在趾短屈肌（flexor digitorum brevis, FDB）中表达荧光标记蛋白的实验方案。该方法的条件已优化，可在最小化肌肉损伤的同时，获得大量高质量表达电穿孔质粒的肌纤维。本方法采用多种蛋白的荧光标记技术，结合高分辨率共聚焦显微镜，可实现活细胞成像，包括激光诱导损伤后的成像。荧光染料与荧光标记蛋白成像相结合，可提供关于肌肉基本结构及其对刺激反应的信息。

引言

单个肌纤维是体积大且高度有序的合胞体细胞。目前存在一些用于肌肉研究的细胞培养模型，但这些模型的主要局限性在于无法完全分化为成熟的肌纤维。例如，C2C12 和 L6 细胞系分别来源于小鼠和大鼠 ^1-4在血清饥饿条件下，单核 "成肌细胞样" 细胞停止增殖，退出细胞周期，并启动成肌程序，形成具有肌节的多核细胞，称为肌管。在长期培养条件下，肌管可能表现出收缩特性。 "抽搐" 在培养中。人类细胞系也已建立 ⁵除了这些永生化细胞系外，还可从肌肉组织中分离单核成肌细胞，在类似的血清饥饿条件下可形成肌管。这些细胞系和原代成肌细胞培养物具有很高的研究价值，因其可转染质粒或通过病毒转导，用于研究基本的细胞生物学过程。然而，这些细胞即使在诱导形成肌管后，仍缺乏成熟肌肉组织的许多显著特征。具体而言，肌管远小于成熟的单个肌纤维，且不具备肌纤维的正常形态。更重要的是，肌管缺乏横行（T-）小管系统，而T-小管是实现高效Ca²⁺²⁺ 在整个肌浆中释放。

一种替代原代成肌细胞或成肌细胞系的方法是使用成熟的肌纤维。可通过转基因技术实现标签蛋白的表达，但该方法成本较高且耗时较长。 体内 小鼠肌肉电穿孔已成为一种首选方法，因其具有快速和可靠的特点 ^6-10.

方法 体内 电穿孔及肌纤维的高效分离已针对小鼠趾....

方案

本研究中的方法均按照西北大学范伯格医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的指南，以符合伦理的方式进行。已尽一切努力将动物痛苦降至最低。

1. 实验步骤 体内 小鼠足底短屈肌（FDB）肌束的电穿孔

1. 设计质粒 体内 使用已知可在哺乳动物细胞中表达的启动子进行表达（例如， 巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）或肌肉中（例如， 肌酸激酶（肌肉型），MCK ^6,7较大的质粒可能表达水平较低。CMV 启动子已被广泛使用 ^6,7.
2. 从质粒中纯化 E. coli 按照制造商说明，在无内毒素条件下操作。将质粒溶解于无菌、无内毒素的TE缓冲液中，浓度为2–5 µg质粒/µl。
3. 将质粒稀释并分装，每份加入无菌微量离心管中，每管含20 µg DNA溶于10 µl无菌无内毒素TE缓冲液（2 µg/µl），每次注射准备一份。
4. 将透明质酸酶储备液用不含钙和镁的无菌磷酸盐缓冲液（PBS-/-）稀释至1倍浓度，使终浓度为8单位。将稀释后的透明质酸酶每10 µl分装至无菌微量离心管中，用于每次注射。
5. 使用2.5%异氟烷麻醉小鼠，直至其进入镇静状态，对尾部或足趾夹捏无反应。将动物仰卧置于加热垫或加热台上，以维持正常体温。
6. 用聚维酮碘消毒液和酒精交替擦拭小鼠足....

结果

电穿孔是一种微创技术，可高效地将纯化的质粒DNA导入趾短屈肌（FDB）肌束（图1A）。转染后7天，可在分离的肌纤维中观察到荧光标记的蛋白（图1B）。随后将分离的纤维接种并制备用于共聚焦显微镜成像。纤维可接受激光诱导的损伤。FM染料可用于识别细胞膜损伤部位（图1C）

在消化过程中，少数肌纤维可能会受到损伤（白色箭头）（图2A）。受损的肌纤维可通过肌膜（肌纤维细胞膜）上出现的膜出泡现象进行识别（黑色箭头）。受损纤维不适合进一步实验，不应使用。代表性共聚焦图像显示了荧光融合蛋白在分离得到的肌纤维中的表达情况（图2B）。使用CMV启动子可在肌纤维中驱动最佳的蛋白表达水平。DIC成像显示一条状态良好的肌纤维。在损伤发生前，FM 4-64在膜上的信号水平较低（图2C

讨论

利用电穿孔技术研究荧光标记蛋白 体内 非常适合用于肌肉研究，因为目前尚无能够真实再现肌肉完整细胞结构的合适细胞系模型。本方案描述了如何利用电穿孔和高分辨率共聚焦显微镜技术，对激光损伤后蛋白质的定位与转位进行详细成像。该方法可进一步拓展用于研究其他细胞过程，包括细胞骨架重组、物质运输及细胞融合。

采用本方案，FDB肌束中最多可达90%的肌纤维表达质粒，无论在肌纤维解离前还是解离后，均可通过荧光显微镜轻松观察到。通常表达呈梯度分布，靠近注射部位的区域表达水平较高。由于存在表达梯度，因此可在单次实验中监测不同蛋白表达水平的影响。与所有转染方法一样，该方法受限于过表达相关的问题。值得注意的是，在高水平表达时可能发生蛋白质聚集。根据我们的经验，mCherry荧光标签比增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标签更容易发生聚集，导致蛋白结构域的分辨率和清晰度下降（例如参见⁷中的图4）。此外，mTurquise2和Venus荧光标签均能实现足够的荧光表达，但两者的荧光亮度均低于eGFP。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Life Technologies	11995-073	解剖介质 稀释方法：50 ml +100 g BSA
胶原酶 II 型	Life Technologies	17101-015	肌纤维消化 稀释方法：160 mg / 4 ml DMEM（储存液为 40 mg/ml 分装）
Falcon 12 孔板	Fisher Scientific	877229	肌纤维消化
Ringers 溶液			肌纤维消化与成像 稀释方法：146 mM NaCl 5 mM   KCl 2 mM   CaCl2 1 mM   MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O
1 ml 移液器	Axygen	T-1000-C-R	消化
剃须刀片	Personna	94-120-71	消化
Precision Glide 30 G 针头	BD Biosciences	305128	解剖
1x PBS (-/-)	Life Technologies	14190-250	解剖
Sylgard 184	Fisher Scientific	50-366-794	解剖
镊子	FST by Dumont	#5/45	解剖
镊子	Roboz	RS-4913	解剖
剪刀	World Precision Instruments	500260	解剖
BSA	Sigma	A7906	解剖介质 稀释方法：100 mg/50 ml DMEM
Falcon 60 mm 培养皿	Fisher Scientific	08772B	解剖——用于盛放 Sylgard
黏土			电穿孔
刺激器	Grass	s88x	电穿孔
夹子	Radio Shack	270-356	电穿孔
三碘季胺酚（Triadine）	Aplicare	82-220	电穿孔
Precision Glide 27 G 针头	BD Biosciences	305136	电穿孔
模拟器	Grass	SIU-V	电穿孔
纱布	Covidien	2146	电穿孔
透明质酸酶	Sigma	H4272	注射 稀释方法：将 160 µl PBS (1x) 加入 40 µl 5x 储存液中
1 cc U-100 胰岛素注射器 (28G1/2)	BD Biosciences	329420	注射
Eppendorf 管	Fisher Scientific	02-682-550	注射
35 mm 玻底小培养皿	MaTek	P35G-1.5-14-C	显微成像
FM 4-64	Life Technologies	T-13320	显微成像 稀释方法：终浓度 2.5 µg/ml
FM 1-43	Life Technologies	T-35356	显微成像 稀释方法：终浓度 2.5 µg/ml
无内毒素质粒大提试剂盒	Qiagen	12362	质粒纯化