Создание первичного фибробластов Культуры с уха мыши и хвост тканей

Summary

Опишем простой и быстрый экспериментальную процедуру для генерации первичных фибробластов из ушей и хвостов мышей. Процедура не требует специальной подготовки животных и может быть использован для генерации фибробластов культур от ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней.

Abstract

Первичные клетки получают непосредственно из тканей и, как считается, более представительным физиологического состояния клеток в естественных условиях, чем установленные клеточных линий. Тем не менее, первичных клеточных культур, как правило, имеют конечный срок службы, и их необходимо часто восстановлена. Фибробласты легко доступным источником первичных клеток. Здесь мы обсудим простой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Протокол может быть использован для установления первичных культур фибробластов из ушей, хранящихся при комнатной температуре в течение 10 дней. Когда протокол внимательно следил, загрязнения, вряд ли произойдет, несмотря на использование нестерильных ткани хранится в течение длительного времени в некоторых случаях. Фибробласты быстро размножаются в культуре и может быть расширена до значительного числа перед прохождением репликативной старение.

Introduction

Первичные клетки получают из живой ткани, и культивируют при условиях в пробирке. Это, как правило, предполагается, что первичные клетки больше напоминают физиологическое состояние и генетический фон ткани, из которой они возникли, чем иммортализованных или опухолевых клеточных линий ^1. По этой причине, первичные клетки представляют собой полезную модель для изучения биологического вопросы ^2,3. Однако, в отличие установленных клеточных линий, которые растут на неопределенный срок, в конце концов, первичные клетки претерпевают старение в культуре, и необходимо часто восстановлена.

Обычно используемые первичны....

Protocol

Мышей содержали в свободных от патогенов условиях в соответствии с институциональными принципов вплоть до euthanization (институциональной уходу и использованию животных комитета (IACUC) руководящих принципов в Национальном университете Сингапура и Национального консультативного комитета лабораторных животных исследований (NACLAR) руководящих принципов).

1. Мыши

1. Заказать одну мышь соответствующего генетического фона. Этот протокол основан на ткани, полученной от одного C57BL / 6 мыши.

2. Подготовка полной среде

1. Подготовка полной среды путем добавления следующих компонентов для Roswell Park Memorial инст....

Results

Добыча фибробластов ткани приводит к значительному количеству ткани мусора (Рисунок 1). В отличие от ткани мусора, фибробласты придерживаться тканевой культуре пластиковых поверхностей между день 1 и 3 культуры. Среда фибробластов культур может быть безопасно изменены в день 3 культуры, которые должны значительно уменьшить уровни мусора, присутствующего в культуре (рис 2). Фибробласты отображения удлиненную морфологию и четко видимый цитоплазму (1 и 2). Митотических кле.......

Discussion

Здесь мы предлагаем простой, недорогой и быстрый экспериментальную процедуру, чтобы установить первичные культуры фибробластов из ушей и хвостов мышей. Извлечение должно привести к адгезивных и быстро делящихся фибробластах в течение 3 дней после выделения ткани. Важным ограничением первичных клеток старение, постоянная задержка роста ^15. Использование протокола, фибробластов культуры могут быть пассировать в течение 5 6 раз, прежде чем фибробласты стать стареющей, указывается уплощение клеток, увеличение раз.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	HyClone	SH30027.01
Сыворотка для теленка	плода HyClone	SV30160.03
2-меркаптоэтанол	Sigma-Aldrich	M3148
Аспарагин	Sigma-Aldrich	A4159
Глутамин	Sigma-Aldrich	G8540
Пенициллин/стрептомицин	HyClone	SV30010
Этанол	Merck Millipore	107017	Absolute для анализа
Коллагеназа D	Roche Диагностика	11088866001	От Clostridium histolyticum, лиофилизированная, нестерильная
протеаза проназы	Merck Millipore	53702	От Streptomyces griseus
Трис буфер (pH 8)	1st BASE	1415	Ультрачистый класс
0,5M EDTA (pH 8)	1st BASE	BUF-1053	Биотехнологический класс
10X Фосфатный буферный раствор (PBS)	1st BASE	BUF-2040-10X4L	Ультрачистый раствор
трипсина-ЭДТА 10X	Sigma-Aldrich	59418C-100ML	0,5% трипсин, 0,2% ЭДТА, трипсин гамма, облученный процессом SER-TAIN, без фенола красного, в физиологическом растворе
Амфотерицин B	Sigma-Aldrich	A2492-20мл	250 мкм; г/мл в деионизированной воде, стерильно-фильтрованные
ножницы	Aesculap
Щипцы	Aesculap	AE-BD312R
0.2 μ М шприц фильтр	Sartorius Stedim	16534
70 μ M клеточный фильтр	SPL	93070
Шприц-поршень	Terumo	SS+10L
Криовиальная трубка	NUNC	368362
1,7 мл микроцентрифужная пробирка	Axygen	MCT-175-C
10 см чашка для клеточной культуры	Greiner	664160	Чашка для обработки клеточной культуры
15 мл коническая нижняя трубка	Greiner	188271
50 мл коническая нижняя трубка	Greiner	227261
водяная баня	GFL	1002
Центрифуга	Eppendorf	5810R
Инкубационный шейкер	Sartorius Stedim		Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 световой микроскоп	Carl Zeiss AG