通过灌洗诱导猪肺表面活性物质耗竭作为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型

摘要

在麻醉猪中重复进行肺灌洗可诱导出类似于人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）主要特征的肺损伤。该实验方法通过在37 °C下反复使用0.9%生理盐水灌洗肺部，旨在建立一种可重复的、用于ARDS研究的气体交换障碍和血流动力学改变的实验模型。

摘要

目前已建立多种肺损伤动物模型，用于研究人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）复杂的病理机制，并评估潜在的治疗方法。在麻醉猪模型中，通过重复使用加温的0.9%生理盐水（50 ml/kg体重）进行肺灌洗，可诱导出严重的肺损伤，且肺气体交换功能和血流动力学恶化具有良好的可重复性。在该模型中引入临床常规使用的呼吸和血流动力学监测设备，有助于评估新型治疗策略（如药物、现代呼吸机、体外膜肺氧合装置ECMO），并弥合基础研究与临床应用之间的鸿沟。此外，采用肺灌洗法诱导肺损伤无需注射病原体或内毒素，因而不会干扰对促炎和抗炎细胞因子的检测结果。该模型的一个缺点是肺不张区域的肺组织具有较高的可复张性。对模型进行标准化操作有助于避免实验偏差，确保不同实验之间的可比性，并减少所需实验动物的数量。

引言

尽管已有四十多年深入的研究，人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的死亡率仍然很高，介于40%至50%之间¹。肺损伤的动物模型在研究复杂的病理机制或探索降低死亡率、减少长期功能障碍的新型治疗方法中发挥着重要作用。

已建立多种模型以诱导肺损伤，模拟人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）在大型（例如猪）或小型动物（例如啮齿类）中的部分特征。这些方法差异显著，包括肺动脉输注油酸、静脉（i.v.）输注细菌和内毒素，以及通过盲肠结扎穿刺（CLP）诱导脓毒症相关ARDS的模型。此外，由于大潮气量和高吸气峰压导致的直接肺损伤（呼吸机相关性肺损伤；VILI）、烟雾/烧伤损伤或肺缺血/再灌注（I/R）模型也常被使用²。CLP模型以及使用内毒素的模型存在一个主要缺点，即其伴随的全身性炎症反应会干扰仅由肺损伤引起的生物创伤的分析。此外，某些模型可能需要数小时至数天才可引发肺损伤，例如在大型动物中建立VILI模型的情况。

通过反复肺灌洗清除表面活性物质以诱导肺损伤的方法，最初由 Lachmann et al. 在豚鼠中描述³，是一种高效且可重复地诱导肺功能与力学功能受损以及肺血管阻力改变的时间经济型方法。将该模型应用于体重约30-60 kg的机械通气猪，可支持使用临床常规机械通气机、导管和监护仪开展基础研究，同时气体交换与血流动力学的....

方案

实验在德国柏林夏里特—柏林大学医学中心实验医学系（根据 EN DIN ISO 9001:2000 认证）进行，并在实验开始前获得德国柏林联邦动物实验管理机构的批准。所有实验均遵循实验室动物护理原则，符合欧洲和德国实验动物科学学会的指导方针。

1. 动物福利与实验动物

1. 所有实验均在完全麻醉的雄性猪（德国兰德拉斯 × 大白猪）上进行，猪的年龄为3-4个月，体重为30-60 kg。

2. 麻醉、插管和机械通气

1. 麻醉前 12 小时禁食，以避免猪胃内食物过满，但可自由饮水，以尽量减少应激。
2. 在动物仍置于箱内以尽量减少应激的情况下，将氟哌利多（azaperone，3 mg/kg）、阿托品（atropine，0.03 mg/kg）、氯胺酮（ketamine，25 mg/kg）和赛拉嗪（xylazine，3.5 mg/kg）混合后注射至猪颈部肌肉，用于术前给药。
   1. 将动物置于担架上，麻醉达到适当水平后，用布遮盖眼睛以进行转运。
   2. 将猪转运至手术室，并始终保持其鼻部通畅，以确保充分的自主呼吸。
   3. 将猪置于俯卧位，并使用适合动物吻部的面罩，以高流量氧气进行预充氧（例如 10 L/min
3. 开始监测外周血氧饱和度（S_p

结果

肺灌洗期间，P_aO₂/F_IO₂ 比值会下降，但单次灌洗的确切影响难以预测。我们从第三次灌洗开始采集动脉血气样本，以监测 P_aO₂/F_IO₂ 比值是否降至 100 mmHg 以下。一旦 P_aO₂/F_IO₂ 比值降至 100 mmHg 以下，需在 PEEP ≥ 5 cm H₂O 的条件下维持该比值低于 100 mmHg 达一小时。这可确保诱导出符合 ARDS 柏林定义的肺损伤。血气和血流动力学的伴随变化可能在数小时内保持“稳定”，也可能进一步恶化，甚至有所改善，具体取决于呼吸机设置（图5）。若在为期一小时的基线观察期间，P_aO₂/F_IO₂ 比值回升至 100 mmHg 以上，.......

讨论

本文介绍了一种通过反复肺灌洗清除表面活性物质以在猪体内诱导严重肺损伤的逐步操作方法。该特定方法能够实现肺功能和肺血管阻力的可重复且可比较的恶化。必须对猪进行灌洗，直至动脉血氧分压与吸入氧浓度比值（P_aO₂/F_IO₂）降至100 mmHg以下，并持续维持在100 mmHg以下达1小时。一旦达到此标准，若不实施肺复张操作^4,8，动物通常至少在4至8小时内无法从肺损伤中恢复。遵循本方案有助于提高使用相同动物模型的不同实验之间研究结果的可比性。

通过灌洗诱导肺损伤存在若干局限性。首先，反复灌洗可导致出现一些人类急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的组织病理学特征，包括大面积肺不张的形成、血管周围水肿以及肺泡-毛细血管膜厚度的增加。然而，该模型中并未观察到某些重要特征，例如严重的上皮损伤或透明膜的形成^2,9。

其次，与油酸输注或气管内灌注所致的肺损伤相比，高吸气压和增加PEEP在灌洗诱导的犬肺损伤中似乎具有更强的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Evita Infinity V500	Dräger		重症监护呼吸机
Vigilance I	Edwards		监护仪
Vasofix Braunüle 20G	B Braun	4268113B	外周静脉导管
Mallinckrodt 气管插管带套囊	Covidien	107-80	8.0 mm 内径
MultiCath3	Vygon	157,300	三腔中心静脉导管，20 cm 长度
Leader Cath 套件	Vygon	115,805	动脉导管
经皮鞘管导入套装	Arrow	SI-09600	用于 4-6 Fr. 肺动脉导管的导入鞘管，10 cm 长度
Swan-Ganz True Size 热稀释导管	Edwards	132F5	肺动脉导管，75 cm 长度
流通式热敏电阻室	Baxter	93-505	用于测量心输出量
导尿管			无特定型号要求