Описаны современные протоколы для поддержания иммортализованных мультипотентных клеток отического предшественника (iMOP) и отической дифференцировки. Выделены условия культивирования и молекулярные маркеры, указывающие на дифференцировку в сенсорный эпителий и спиральные ганглиозные нейроны (SGN).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Инициирование дифференциация в увековечена МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ ушные клетки-предшественники
* These authors contributed equally
В этой статье
Уведомление об исправлении
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Краткое содержание
Аннотация
Использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC) или эмбриональных стволовых клеток (ESC) для клеточной заместительной терапии имеет большие перспективы. Несколько ограничений, включая низкую урожайность и гетерогенные популяции дифференцированных клеток, препятствуют прогрессу терапии стволовыми клетками. Была создана ограниченная судьбой линия клеток мультипотентного отического предшественника (iMOP) для обеспечения эффективной дифференцировки большого количества функциональных волосковых клеток и спиральных ганглиозных нейронов (SGN) для заместительной терапии клеток внутреннего уха. На основе диссоциированных культур одиночных iMOP-клеток были описаны протоколы, способствующие выходу из клеточного цикла и дифференцировке за счет отмены основного фактора роста фибробластов (bFGF). Значительное снижение пролиферирующих клеток после отмены bFGF было подтверждено с помощью анализа пролиферации клеток EdU. Одновременно со снижением пролиферации успешная дифференцировка приводила к экспрессии молекулярных маркеров и морфологическим изменениям. Иммуноокрашивание Cdkn1b (p27KIP) и Cdh1 (E-кадгерин) в отосферах, полученных из iMOP, использовалось в качестве индикатора для дифференцировки в сенсорный эпителий внутреннего уха, в то время как иммуноокрашивание Cdkn1b и Tubb3 (нейрональный β-тубулин) использовалось для идентификации нейронов, полученных из iMOP. Использование клеток iMOP является важным инструментом для понимания решений о судьбе клеток, принимаемых нейросенсорными предшественниками внутреннего уха, и поможет разработать протоколы для создания большого количества волосковых клеток, полученных из iPSC или ESC, и SGN. Эти методы ускорят усилия по созданию глазных клеток для заместительной терапии.
Введение
Органы внутреннего уха, улитка, утрикула, мешочек и три полукружных канала, опосредуют способность слышать и удерживать равновесие. В улитке волосковые клетки преобразуют звуки в электрические сигналы, которые передаются на спиральные ганглиозные нейроны (SGN). SGN активируют потенциалы действия для распространения нейронных сигналов по слуховой цепи. Генетические мутации, ототоксичные препараты и воздействие громких звуков способствуют гибели волосковых клеток и SGN, что приводит к потере слуха1-4. После утраты эти элементы не заменяются. Использование iPSC и ESC для генерации зарождающихся волосковых клеток или SGN имеет большие перспективы для замести....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Поддержание самообновления клеток в ППМН
- Подготовка ИМОП питательных сред: DMEM / F12, 1X B27 дополнения, 25 мкг / мл carbenecillin и 20 нг / мл оФРФ. Сделайте 50 мл культуральной среды ИМОП используя стерильные реагенты. Разминка 49 мл DMEM / F12 в 50 мл конической в водяной бане при 37 °.
- Оттепели 50X В27 добавки и стерилизованным фильтрацией 100 мг / мл аликвоты carbenecillin в течение 5 мин на водяной бане при 37 ° C. Оттаять 100 мкг / мл аликвоты оФРФ при комнатной температуре. Добавить 1 мл 50Х В27, 10 мкл 100 мкг / мл и 12,5 оФРФ мкл 100 мг / мл carbenecillin в DMEM / F12.
- Используйте 3 мл СМИ в 60 мм блюдо культуры....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
оФРФ Снятие Уменьшает распространение в ППМН клеток
Для уменьшения пролиферативной способности клеток ИМОП и инициировать дифференцировку клеток ИМОП, оФРФ был снят из культур. Чтобы подтвердить, что фактор роста вывод уменьшается пролиферацию, EDU инкорпорация используется в качестве анализа пролиферации. Процент клеток, которые включены EDU с otospheres культивируемых с ИМОП культуральной среде (содержащей о.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мониторинг линии ППМН культур
Протокол для поддержания самообновления и продвижение дифференциации нового линии клеток ИМОП описано и дополнительные форматы обшивки включены (таблица 1). Отмечены несколько важных шагов, которые помогут с рутинной расширения и дифференциации клеток ИМОП. Подобно плюрипотентных стволовых клеток культур, ИМОП клетки теоретически имеют неопределенный срок службы. Чтобы убедиться, что клеточные линии надлежащим образом, мониторин.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Работа была частично поддержана Фондом развития факультета Дункана и Нэнси Макмиллан (K.Y.K.), Грантом биомедицинских исследований Буша (K.Y.K.) и Грантом Рутгерса на развитие факультета (K.Y.K.).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| CoolCell LX Безспиртовые контейнеры для заморозки клеток | BioCision | BCS-405 | |
| Криогенные флаконы (2 мл) | Стеклянный | 430654 | |
| толщиной 1,5 мм (круглый 12 мм) | Электронная микроскопия | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Нейробазал Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) pH 7,4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Сбалансированный солевой раствор (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| Добавка B27 (50X) Сыворотка Free | Life Technologies | 17504-044 | Хранится в виде 1 мл аликвот |
| L-глютамин (200 мМ) | Life Technologies | 25030-081 | Хранение в виде аликвот 5 мл |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Хранение в виде аликвот 1 мг/мл |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-a-Freeze Криоконсервационный носитель | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Mountant | Life Technologies | 47743-736 | Хранится в концентрации 10 мг/мл 100 &микро; l aliquots |
| Moxi Z Mini Автоматизированный счетчик ячеек | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z кассета типа S | Orflo | MXC002 | |
| Рекомбинантный фактор роста мышиных фибробластов, базовый (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Ресуспендирован в 0,1% BSA в H20 и хранится в виде аликвот 20 мг/мл |
| Poly-D-лизин | Sigma | P7886 | Ресуспендирован в 1X PBS и хранится в дозе 10 мг/мл 100 &микро; l аликвоты |
| Карбенициллин, Динатриевая соль | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Ресуспендирован в 10 мМ Hepes pH 7,4 и хранится в виде 100 мг/мл аликвоты |
| 5 мл пипетка в индивидуальной упаковке в мягкой обложке (200 / кейс) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 мл пипетка в индивидуальной упаковке в мягкой обложке (200 / кейс) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Обработанная культурой тканей Biolite 24-луночная пластина | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| культурой тканей Biolite 6-луночная пластина | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Обработанная культура тканей 6 см Тарелка | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Стерильный шприц PVDF Фильтр Размер пор: 0,22 мкм; m | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne фильтрующие наконечники для пипеток 0,1 - 10 мкм; l удлиненный фильтрующий наконечник | США Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne фильтр пипетки наконечники 1 - 20 μ l фильтрующий наконечник | США Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne фильтр наконечники для пипеток 1 - 200 μ l фильтрующий наконечник | США Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne фильтр наконечники для пипеток 101 - 1000 μ l фильтрующий наконечник | США Scientific | 1126-7810 | |
| 15 мл конические пробирки стерильные 20 пакетиков по 25 туб (500 туб | США Scientific | 1475-0511 | |
| конические тубы 50 мл конические тубы стерильные 20 пакетиков по 25 туб (500 туб) | США Scientific | 1500-1211 |
Ссылки
- Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary'....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Исправление
Formal Correction: Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to the Authors section in: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells.
One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
to:
Azadeh Jadali
Больше статей
Дифференцировка клеток iMOPпротокол отмены bFGFанализ пролиферации клеток с помощью EdUиммуноокрашивание на Cdkn1b и Cdh1иммуноокрашивание на Cdkn1b и Tubb3формирование отосфер методом гравитационного осаждениясреда для нейрональной дифференцировкидифференцировка сенсорного эпителиязамещение клеток внутреннего уха
