여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 발달 중 형태 생성 과정의 변경을 제어하는 신호 전달 경로를 해부하려면 강력하고 민감한 메트릭이 필요합니다. 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장은 세로축을 따라 배아가 늘어나는 후기 발달 단계입니다. 이 발달 단계는 피하 세포와 기저 체벽 근육 사이의 세포 간 통신에 의해 제어됩니다. 이러한 신호 전달 메커니즘은 세포골격(cytoskeleton)과 세포-세포 접합부(cell-cell junctions)를 리모델링하여 피하 세포의 형태를 조절합니다. 유충 단계에서 배아 치사율 및 발달 정지를 측정하고 피하 세포와 근육 세포에서 세포 골격 및 세포-세포 접착 구조의 변화를 측정하는 것은 이러한 신호 전달 경로를 해부하기 위해 25년 이상 사용되어 온 고전적인 표현형입니다. 최근의 연구에서는 특히 조기 또는 후기 신장을 목표로 하고 배아의 전후 축을 따라 형태 생성 결함을 특성화하는 새로운 측정 방법의 개발을 필요로 했습니다. 여기에서는 신장 배아의 길이와 너비, 동기화된 유충의 길이를 정확하게 측정할 수 있는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 방법은 신장을 조절하는 유전자를 식별하고, 이러한 유전자가 이 단계의 초기 및 후기 단계를 모두 제어하고 배아의 전후 축을 따라 균등하게 필요한지 여부를 평가하는 데 유용한 도구를 구성합니다.
서론
짧은 라이프 사이클 : 거의 50 년 동안 선충 예쁜 꼬마 선충 개발, 신경 생물학, 진화, 호스트 병원체 상호 작용 등의 중요한 문제를 연구하는 강력한 모델로 자리 매김 한 개발의 연구에서이 모델의 강도에 달려있다 삼일의; 이러한 동물은 유전자 조작 될 수있는 용이성; 대부분 여분의 자궁이다 살아있는 동물과 개발에 세포 변위 및 형태의 관찰을 가능하게 투명성. 선충의 발달 단계는 성인이 다음에 배아 네 애벌레 단계 (L4에 L1)를 포함한다. 배아 발생 동안, 표피 형태 형성 세포는 그들의 접합부를 재구성하는 방법을 그룹으로 마이그레이션 방법 상피의 더 나은 이해를 가능하게하고 개별적인 형태뿐만 아니라 기능적 상피 세포 내에서의 상대 위치를 수정하는 능력에 상당한 관심을 끌었다.표피의 형태 형성은 네 단계로 구분됩니다 지느러미 표피 세포의 구조 조정에 구성된 지느러미 인터에서, 하피라고 함; 따라서 상피 세포 단층의 배아를 감싸는 복부 정중선으로 복부 피하 세포의 이동에 구성된 복부 인클로저; 초기와 후기 신장 벌레 모양의 유충에 콩 모양의 배아를 변환. 다음과 같은 형태 형성, 배아 해치 및 L1 유충은 즉시 환경에서 사용 가능한 박테리아를 사용하여 먹이를 시작합니다.
배아 신장 따라....
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프로토콜
WT 및 돌연변이 동물의 초기 신장 결함 1. 특성
- Normarski DIC 현미경에 대한 설치 배아
- 다음 문화 매체와 재료를 준비합니다 :
- M9 버퍼, 용해 12.8 g / L 나 2 HPO 4 • 7H 2 O 3 g / L KH 2 PO 4, 5 g / L의 NaCl, 0.25 g / L 황산 증류수와 소독하는 오토 클레이브에서 4 • 7H 2 O.
- NGM 판, DDH 2 O 3 g / L의 NaCl 16 g / L의 한천, 2.5 g / L의 bactopeptone을 용해 압력솥과 1 mM의 황산, 1 mM의 염화칼슘 2, 1 mM의 인산 완충액 5 μg의 / ㎖ 콜레스테롤을 추가합니다. 60mm 요리 당 NGM 6 ml에 따르십시오. 매체가 실온에서 24 시간 동안 응고하도록 허용합니다. E.의 포화 문화의 몇 방울을 추가 대장균 OP50 박테리아는 루리아의 국물 (LB)에서 재배. 박테리아가 48 시간 동안 성장, 4 ° C에서 접시를 저장할....
- 다음 문화 매체와 재료를 준비합니다 :
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결과
헤드폰, Tail- 및 헤드 / 테일 폭 비율은 강력한 지표입니다.
여기에 설명 된 프로토콜이 성공적으로 조절기와의 Rho GTP 아제 PIX-1의 이펙터 기능, 박-1 특성화 렛 502 초 신장 7 동안 사용되어왔다. 구아닌 교환 인자 PIX-1 각각 박 -1- 코드 (GEF)과 RHO-1 7 이펙터에 대한 라 세미 / Cdc42 GTP 아제에 대한 구체적이고 할 수-502 코드 .......
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토론
이 프로토콜은 초기 특성화하는 새로운 메트릭 및 배아 신장의 후반 단계에 대해 설명합니다.
섹션 1에서 중요한 단계는 패드 박테리아의 잠재적 인 존재이다. 배아는 밀봉 패드와 이미지 수집시 커버 슬립 사이에 동봉되어 있습니다. 슬라이드를 씰링하는 두 시간 이상 지속 취득 중에 동물의 탈수를 방지하기 위해 필요하다. 우리의 지식, 슬라이드와 커버 슬립 사이의 아가로 오스 패드를 장착하는 데 사용되는 실러의 아무도는 통기성 없습니다. 박테리아 (또는 배아) 다량의 패드 상에 존재하는 경우에 결과적으로, 그들은 그들의 조기 사망에 이르는 몇 시간 후, 산소를 박탈 할 수있다. 3 배 배아를 갖는 - 비 신장 배아에 비해 길이가 3 배입니다 배아에 해당하는 - 잠재적 인 저산소 조건의 좋은 지표가 될 것이다 관심의 배아와 함께 기록, 그 배아가 파묻혀 이동을 중지하기 때문에산소가없는 상태에서의 R 달걀 껍질. 어떤 형태 학적 측정은 저산소 조건 또는 죽은 배아에서 수행 될 수 없습니.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)와 캐나다 혁신 재단의 보조금으로 지원되었습니다. let-502 (sb118ts) 균주에 대해 Paul Mains 박사 (캐나다 캘거리 대학교)에게 감사드립니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center에서 제공했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 한천 | BioShop | AGR001.500 | |
| 아가로스 | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (염화칼슘) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| 콜레스테롤 | 시그마-알드리치 | C8667 | |
| 세척 용액 | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| 유리 커버슬립 | Fisherbrand | 12-542B | |
| 유리 슬라이드 | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| 고형광 제어 입자 | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4(인산칼륨, 이염기성) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| K2HPO4(인산칼륨, 일염기성) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4(황산마그네슘) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4(인산나트륨, 이염기성) | Bio Basic Inc. | ||
| NaCl (염화나트륨) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo 드로잉 껌 45 ml | pé bé o | 모든 예술/공예품 매장 | PDG033000 |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
참고문헌
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elong....
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