Method Article

Эпикардиального вырост Культура Анализ и Ex Vivo Оценка эпикардиального производный миграции клеток

DOI:

10.3791/53750

⸱

March 18th, 2016

 ,  , 
1Aab Cardiovascular Research Institute, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Department of Medicine, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 3Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем методы выделения первичных эпикардиальных клеток мыши с помощью анализа культуры роста и оценки функциональной миграции эпикардиальных клеток (EPDC) с использованием системы культивирования сердца ex vivo. Эти протоколы подходят для идентификации генетических и химических модуляторов эпикардиального эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП) и подвижности.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Один слой эпикарда клеточных линий сердца, обеспечивая паракринной факторов, которые стимулируют пролиферацию кардиомиоцитов и непосредственно способствует сердечно-сосудистых клеток-предшественников во время развития и болезней. В то время как ряд факторов, которые были вовлечены в клетки (EPDC) мобилизации эпикарда происхождения, механизмы, регулирующие их последующую миграцию и дифференцировку плохо изучены. Здесь мы представляем в пробирке и стратегии бывших естественных условиях для изучения EPDC моторику и дифференциации. Во-первых, мы опишем метод получения первичных эпикардиальные клеток путем вырост культуры из эмбрионального сердца мыши. Введем также подробный протокол для оценки трехмерной миграции меченых EPDC в системе органной культуры. Мы предоставляем доказательства того, используя эти методы, что генетическое удаление myocardin связанных факторов транскрипции в эпикарда затухает миграции EPDC. Такой подход служит платформой для оценки кандидатов модификаторов EPDCбиологии и может быть использовано для разработки генетических или химических экранов для выявления новых регуляторов мобилизации EPDC, которые могут быть полезны для сердца ремонта.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпикард представляет собой один слой мезотелиальной клеток, что линии сердца и последствия развития сердца, созревание и ремонт. Благодаря хорошо скоординированным обмена паракриновых сигналов, Интимной диалог между миокарда и эпикарда является необходимым условием для остановки роста и формирования не-миоцитов сердца родословных 1. Эпикардиального клетки , полученные из (EPDC) выходят из подмножества эпикарда клеток через эпителиальные-к-мезенхимальных перехода (EMT) 2, вторгнуться в субэпикардиального пространство и основной миокард и дифференцируются в основном в коронарных сосудов стенной клеток и сердечных фибробластов, а также к в меньшей ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Все эксперименты с мышами были одобрены Университетской комитета по изучению ресурсов животного мира при Университете Рочестера с.

1. эпикардиального вырост Культура Анализ (Рисунок 1А)

  1. Препараты
    1. Подготовка 5 мл среды А для первичной изоляции эпикарда клеток путем дополнения среды 199 (М199) с 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (Pen / Strep).
    2. Предварительно теплая среда А и 100 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) в C водяной бане при 37 °.
    3. Разрешить коллаген покрытием камерные слайды нагреться до комнатной температуры в течение 30 мин.
    4. Добавьте 100 мк....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпикард может быть эффективно изолированы с использованием анализа культуры нарост, воспользовавшись его внешней расположения и эксплуатации пластичностью развития и предлагает внутреннюю миграционную поведение EPDC. Мышиные эмбриональные сердца изолированы на E11.5 до эпикарда EMT и кисло спинной стороной вниз на коллагеновых покрытием камеры слайдах 26 (Фигура 1А, Б). Эксплантировали сердца будут продолжать сокращаться; Тем не менее, эпикарда будет прилипать.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы приводим подробные методы , чтобы изолировать первичную эпикардиального клетку путем разрастания и отслеживать миграцию EPDC в бывших естественных культурах сердца. Для нарост культур, подходящее время для удаления эпикарда обедненного сердце изменяется незначительно между экспериментами. Периодический мониторинг эксплантов после инкубации в течение ночи рекомендуется, чтобы оценить степень эпикардиального выроста и извлечь сердце, прежде чем появляются фибробласты. Для обеспечения чистоты сердца должн.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EMS была поддержана грантами от Национальных Институтов Здоровья (NIH) [номер гранта R01HL120919]; Американской ассоциации сердца [номер гранта 10SDG4350046]; Университет Рочестера CTSA награду от NIH [номер гранта UL1 TR000042]; и запуска средства из Aab CVRI. MAT была частично поддержана грантом в Университете Рочестера школы медицины и стоматологии от Med INTO-Град Инициатива Медицинского института Говарда Хьюза; и Национальной премии Сервис Исследования Institutional Ruth L. Kirschstein из NIH [номер гранта GM068411].

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Модифицированный Eagle Medium Hyclone от Dulbecco SH3002201DMEM
Hanks' Balanced Salt SolutionHycloneSH3003102HBSS
Medium 199HycloneSH3025301M199
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер HycloneSH3002802DPBS
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаБлизнецы 100-106FBS
Раствор пенициллина/стрептомицинаHycloneSV30010
Corning Biocoat Collagen I, 4-луночные предметные стеклаCorning354557
Multiwell 24-луночные планшетыFalcon08-772-1
Препарирующий микроскопLeicaM50Оснащенный светодиодом Leica KL300 может стать источником
конфокального микроскопаOlympus1X81Оснащен мули-аргоновым лазером 405/488/515, FV10-MCPSU лазером 405/440/635, лазером 559, а также ртутной лампой
BioruptorDiagenode UCD-200
Трансформирующий фактор роста бета 1R& D Systems100-B-001TGF-β 1
Тромбоцитарный фактор роста BBR& D Systems220-BB-010PDGF-BB
Тризол РеагентПрикладной Биосистемы15596-026Осторожно, опасный материал
ТУРБО Набор без ДНК LifeTechnologiesAM1907DNaseI
iScript набор для синтеза кДНКBioRad1708891
UltraPure GlycogenLife Technologies10814-010
SYBR ЗеленыйBioRad170-8880
Коктейль ингибтора протеазыRoche11836170001
Alexa Goat-anti-rabbit 488Life TechnologiesA11008Вторичное антитело
Alexa Goat анти-кролик 594Life TechnologiesA-11012Вторичное
антитело Alexa Goat анти-мышь 594Life TechnologiesA-11005Вторичное антитело
Мышиный альфа-актин против гладкой мускулатуры, Cy3-конъюгированный  Sigma-AldrichC6198моноклональное антитело, клон 1A4
Мышь против опухоли Вильмса 1 (WT1)Life TechnologiesMA1-46028моноклональное антитело, клон 6F-H2
Rabbit anti-ZO1Life Technologies40-2200поликлональное антитело
Rabbit anti-Collagen Type 4MilliporeAB756Pполиклональное антитело
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Дигидрохлорид Life TechnologiesD1306DAPI
Флуоресцентная монтажная среда DAKOS3023
16% раствор параформальдегидаЭлектронная микроскопия Sciences15710PFA разведенный до 4% в DPBS. Осторожно, опасный материал
СахарозаSigma-AldrichS0389
Ткань замораживающая средаТреугольник Биомедицинские наукиTFM-B
Пап-ручкаDAKOS2002
Одноразовые лезвия для митротома Сакура Finetek4689
Предметные стеклаGlobe Scientific1358 Втположительно заряженные, 25 мм x 75 мм x 1 мм
Криостат LeicaCM1950
ЩипцыFine Science Tools11295-00
Хирургические ножницыFine Science Tools91460-11
Одноразовые базовые формыFisher Scientific22-363-553
КетаминHospiraNDC 0409-2051-05
КсилазинAkornNADA 139-236

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
  2. Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is require....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epicardial CellsEPDC MigrationOutgrowth CultureEx Vivo AssayEmbryonic HeartCell IsolationAdenovirus LabelingTGF Beta TreatmentEpithelial Mesenchymal TransitionMyocardin Related Transcription Factor

Related Articles