여기에서는 Plasmodium sporozoites의 피내 주사 후 마우스 피부에서 골수성 세포를 분리하고 림프절을 배출하는 프로토콜을 설명합니다. 수집된 세포의 유세포 분석은 기생충에 대한 피부 및 배액 림프절 염증 반응을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 분석을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
변형체의 포자 소체 단계는 모기에 물린 통해 포유 동물 숙주의 피부에 접종 할 때 말라리아 감염이 시작됩니다. 고도의 운동성이 기생충뿐만 아니라 간세포에 침입 및 적혈구-감염 형태로 변환 할 수있는 간 도달한다. 또한 피부에 그것을 인식하고 상주 및 / 또는 보충 골수 세포에 의해 분해 될 수있는 주사 부위를 배출 근위 림프절로 이동한다. 생체 내에 영상은 밝은 형광리스-GFP 긍정적 인 피부 백혈구 및 배수 림프절의 포자 소체와의 CD11c + 세포 사이의 상호 작용의 초기 모집을보고했다. 우리는 여기서, 복구 식별하고 마우스 피부에 모집 및 쥐 모델에서 포자 소체의 용량을 면역의 피내 주사 다음과 림프절을 배출하는 골수 세포 하위 집합을 열거 할 수있는 효율적인 방법을 제시한다. 표현형 특성을 사용하여 다중 매개 변수 흐름 세포 계측법 제공신뢰할 수있는 분석은 말라리아 감염에 염증 반응시 초기 동적 세포 변화를 평가한다.
서론
말라리아는 매년 50 만 명이 사망 세계에서 가장 치명적인 전염병 중 하나입니다. 변형체, 질병의 원인 에이전트에 의한 감염은 미리 적혈구 (PE) 단계에 의해 시작된다. 이 단계에서, 여성 Anopheline 모기에 의해 숙주의 피부에 주입 포자 소체는 혈류를 통한 간 도달 질병의 증상을 적혈구를 감염 원인 기생충 형태로 내부 간세포 분화.
변형체의 PE 단계는 항 말라리아 예방 접종에 대한 권한이 대상을 나타냅니다. 실제로, 방사선 감쇠 포자 소체 (RAS) 이러한 단계에 대한 약독 화 백신, 살, 유전자 체포 기생충 (GAP) 또는 화학적 예방 및 포자 소체 (CPS)는 설치류와 인간의 호스트 1-9을 보호하기 위해 자신의 능력을 증명하고있다. 설치류 모델에서 대부분의 백신 연구는 정맥 내 면역화를 이용하는 실시하고보호 효과의 측면에서 황금 표준이되는 것입니다. 그러나, 피부 단계의 설명 및 보호를 유도에서 피부 - 관련 배수 림프절 (DLN)의 중요성은 PE상의 우리의 인식 변화와 주사 피내 경로의 중요성을 강조 하였다. P.의 생체 내에 영상 쥐의 피부에 주입 berghei의 포자 소체는 접종의 ~ 25 %가 혈류를 통해 간 도달 ....
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프로토콜
모든 절차는 파스퇴르 연구소의위원회와 지역 동물 실험에 대한 윤리위원회 (윤리위원회 IDF-파리 1, 파리, 프랑스, 계약 번호 : 2012-0015)에 의해 승인하고, 해당 지침과 규정에 따라 수행.
1. 재료 및 시약
- 이전 21 설명 된대로 3~5일 출현과 후면 후 감염된 쥐에 먹이 여성 아노 펠 레스 stephensi 모기 (Sda500 변형)를 사용합니다.
- 사용 기생충 구성 적 열 충격 단백질 70 (HSP70) 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 발현 변형체 berghei ANKA 클론. 이 기생충의 라이프 사이클에 걸쳐 22 밝은 형광을 산출한다.
- 사용 여성 C57BL / 6JRj 마우스 (7 주령).
참고 : 설명 프로토콜에 사용 된 모든 시약은 재료 / 장비의 수 T에 나열되어 있습니다.
- 전염성 혈액 식사 후 18~25일 사이에 수집하고 이전 21 설명 된 바와 같이 얼음에 15 ML 튜브로 모기를 초기 마취. 조심스럽게 튜브를 반전하....
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결과
우리는 최근 P.의 면역 용량의 바늘 주사기 주입을 입증 마우스 피부는 피부와 DLN (19)의 염증성 단핵구 다음 다형 핵 호중구의 연속 채용을 유도에 berghei은 포자 소체. 프로토콜 절 위에 성공적으로 이어 진피 포자 소체의 다수의 다중 분사 다음 두 조직으로부터 살아있는 골수 세포를 분리하기 위해 사용 된 절차에 상세 설명 (도 1 및도 2). 계측법 멀티 파라 흐름에 의해 세포의 침윤을 분석하여도 5에 요약 된 바와 같이 처음 24 시간 이내에, DLN (도 3)와 피부 주사 부위 (도 4) 및 절연 처리 하였다. 전반적으로,이 기술은 평균 104 CD45 + CD11b를 +와 2.10 4.......
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토론
전체 포자 소체 말라리아 백신을 사용한 인간의 대규모 예방의 관점에서 극복하는 주요 문제점 중 하나는 성공적인 면역 보호 (24, 25)을 위해 최적화 된 경로와 기생충 투여 방법을 개발하는 것이다. 인간에서, 약독 기생충 (LAP)에 의해 매개되는 예방 효과의 평가는 다음 천연 모기 수행 된 2뿐만 아니라, 피내, 피하 25, 26 및 27 IV 면역 물린. 설치류 (28) 및 비 - 인간 영장류 (25)에보고 된 바와 같이, LAP의 IV 투여는 전술 한 노선에 비해 더 강력한 보호 성 면역 반응을 유도한다. 그럼에도 불구하고, 바늘 및 주사기를 사용하여 투여 이외 IV 경로는 여전히 인간 질량 접종 적합 남아 노력은 현재 자신의 보호 효능을 최적화하도록 이루어지고있다.
마우스에서 실시 최근 연구에서 입증특히, ID 경로의 경우에는 D, 즉 큰 부피로 희석.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 마우스 피부에 포자 소체의 운동의 생체 내 이미징에서 교육에 대한 사진과 바울 Formaglio을 복용에 도움을 패트리샤 Baldacci, 바네사 Lagal과 사빈 Thiberge 중요한 읽기, 이리나 Dobrescu 보낸 및 사빈 Thiberge 감사합니다. 우리는 또한 모기 양육에 대한 생산 및 아노 펠 레스 (CEPIA - 파스퇴르 연구소)의 감염에 대한 마렉 Szatanik와 센터를 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는의 Laboratoire 디부 우수상 "전염병을 신흥의 통합적인 생물학"에서 AXA 연구 기금과 기금에 의해 지원되었다 (아니. ANR-10 LabX에-62-IBEID을 부여).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 케타민: Imalgene® 1,000 | Merial-50 | mg/kg: 사전 포자광 주사 125 mg/kg: 이전 희생 | |
| 자일라진: Rompun® 2% | Bayer-5 | mg/kg: 이전 스포로조이트 주입 12.5 mg/kg: 사전 희생 | |
| NanoFil 주사기 + 35 게이지 바늘 | 세계 정밀 기기 | - | - |
| Omnican® 50 인슐린 주사기 0.5 ml/50 I.U. | B. 브라운 메디컬 | 9151125-MultiwellTM | |
| 6웰 조직 배양 플레이트 – 플랫 바텀 | BD 팔콘 | 353046-70 | |
| &마이크로; M 세포 스트레이너 | BD 팔콘 | 352350-2 | |
| ml 주사기 | Terumo | SS-02S-BLUE | |
| MAXTM 15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 | BD Falcon | 352097-BLUE | |
| MAXTM 50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브 | BD Falcon | 352098-5 | |
| ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브 35 µ m 셀 스트레이너 캡 | BD 팔콘 | ||
| 1x CaCl2- 및 MgCl2--free | Life Technologies | 14190-094-DMEM | |
| 1x + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021-Clostridium | |
| histolyticum의 콜라겐분해효소, Type IV 0.5-5.0 FALGPA 단위/mg 고체 | 시그마-알드리치 | C5138 | 400 U/ml |
| 소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I, type IV | 시그마-알드리치 | D5025 | 50 &마이크로; g/ml |
| EDTA 디소듐 염 | 시그마-알드리치 | E-5134 | 10 mM 또는 2.5 mM |
| FBS | Biowest | S1810-500-HEPES | |
| 버퍼 용액 (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
| Trypan 블루 스테인 (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | 희석 1:10 |
| 안티 마우스 CD16 / CD32 (2.4G2 클론) | BD Biosciences | 553142 | 10 µ g/ml 최종 (1:50) |
| DAPI FluoroPureTM 등급 | Life Technologies | D21490 | 1 µ g/ml 최종 |
| 안티-마우스 CD45 (30-F11 클론) | BD Biosciences | 559864 | 희석 1:200 |
| 안티-마우스 CD11b (M1/70 클론) | BD Biosciences | 557657 | 희석 1:400 |
| 안티 마우스 CD8&알파; (5H10 클론) | 생명 기술 | MCD0830 | 희석 1:100 |
| 암컷 C57BL/6JRj 마우스 (7주령) | Janvier Laboratories | - |
참고문헌
- Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Most, H., Orton, C. Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature. 216 (5111), 160-162 (1967).
- Hoffman, S. L., et al.
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재인쇄 및 허가
