يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
زراعة الخلايا الأولية الأنف طلائي من الأطفال وإعادة برمجة وإلى خلية جذعية مستحثة وافرة القدرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الظهارية الأنفية (NECs) هي جزء من الشعب الهوائية يستجيب لملوثات الهواء وهي الخلايا الأولى المصابة بفيروسات الجهاز التنفسي. كما أنها تشارك في العديد من أمراض مجرى الهواء من خلال استجابتها المناعية الفطرية وتفاعلها مع الخلايا اللحمية المناعية ومجرى الهواء. تحظى NECs بأهمية خاصة للدراسات التي أجريت على الأطفال نظرا لإمكانية الوصول إليها أثناء الزيارات السريرية. تم إنشاء الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (iPSCs) من أنواع متعددة من الخلايا وهي أداة قوية لنمذجة التنمية البشرية والمرض ، وكذلك لتطبيقاتها المحتملة في الطب التجديدي. هذا هو البروتوكول الأول الذي يضع طرقا لنجاح توليد iPSCs من NECs المستمدة من المشاركين في طب الأطفال لأغراض البحث. يصف كيفية الحصول على الخلايا الظهارية الأنفية من الأطفال, كيفية توليد ثقافات NEC الأولية من هذه العينات, وكيفية إعادة برمجة NECs الأولية إلى iPSCs مميزة بشكل جيد. تعتبر عينات الغشاء المخاطي للأنف مفيدة في الدراسات الوبائية المتعلقة بآثار تلوث الهواء عند الأطفال ، وتوفر أداة مهمة لدراسة أمراض مجرى الهواء. يمكن أن تكون الخلايا الأنفية الأولية و iPSCs المشتقة منها أداة لتوفير مواد غير محدودة للأبحاث الخاصة بالمريض في مجالات متنوعة من البيولوجيا الظهارية لمجرى الهواء ، بما في ذلك أبحاث الربو ومرض الانسداد الرئوي المزمن.
المقدمة
الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة من عينات الإنسان (hiPSCs) هي تكنولوجيا سريعة النمو أبحاث الخلايا الجذعية. أنها توفر بديلا لأبحاث الخلايا الجذعية الجنينية (HESC) مع عدد أقل بكثير من العيوب الأخلاقية والمعنوية 1،2. على الرغم من أنها ليست متطابقة epigenetically إلى hESCs 3-5، hiPSCs تقدم طريقة فريدة من نوعها لنموذج الظواهر التنمية والمرض، وأنها يمكن أن تستمد من الأنسجة ذات الصلة للدولة مرض 5-8. يجري باستمرار استكشاف طرق جديدة لتوليد hiPSCs لتحديد أنواع الخلايا الأمثل لتبدأ، باعتبارها وسيلة لإعداد iPSCs GMP ذات جودة مناسبة لزراعة الأعضاء، وأيضا إلى زيادة في الوقت المناسب وكفاءة عملية إعادة برمجة <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يتبع بروتوكول التالية للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث الإنسان والمؤسسات.
1. أخذ عينات من النسيج المخاطي
ملاحظة: الحصول على عينات من الاشخاص الذين تكون خالية من علامات العدوى الفيروسية في الجهاز التنفسي.
- إعداد 15 مل الطازجة المخروطية قبل الزيارة مشارك وإضافة 2 مل BEGM (الشعبي طلائي متوسط نمو الخلايا) بالإضافة إلى 20 ميكرولتر العقيمة بن / بكتيريا / Fungizone (P / S / F) (0.01٪).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الجزء الأول من الأنف، ودعا دهليز الأنف، هي منطقة محاطة غضروف 29. تحتاج الفرشاة لتسير بسلاسة الماضي هذا المجال من الأنف، وراء صمام الأنف (الباطنة الفوهة، أو "الثقب الأسود" رأيت في الجزء الخلفي من n هل)، ويتم الحصول على عينة من المحارة أدنى (الشكل 1). المحارات الأنفية هي هياكل عظمية التي تزيد من مساحة سطح الأنف 29، مما يجعلها موقعا مثاليا لأخذ العينات. واصطف المنطقة أيضا الأنسجة المخاطية أوعية دموية، و.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الخلايا الظهارية الأنفية (NECS) هي منصة الوصول إليها لدراسة أمراض الشعب الهوائية، واللجنة الوطنية للانتخابات، iPSCs توفر وسيلة مثيرة لاستكشاف تطور المرض والعلاج والعلاج 1،31،32. يمكن الحصول عليها NECS دون إجراءات ضارة المجهدة أو يحتمل أن تكون 6،23. في تجربتنا، وعينة من الغشاء المخاطي للأنف كما هو موضح في هذا البروتوكول على ما يبدو أقل إرهاقا وينظر أفضل من جمع الدم للأطفال. لذلك، قد يكون هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص في السكان مرضى الأطفال وذات الصلة لدراسة أمراض.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أنوه المحفزة مرفق الخلايا الجذعية والتصوير الأساسية متحد البؤر في مستشفى سينسيناتي للأطفال. وأيد هذا العمل من قبل R21AI119236 (HJ)، R21AI101375 (HJ)، المعاهد الوطنية للصحة / NCATS 8UL1TR000077-04 (HJ)، U19 AI070412 (HJ) و2U19AI70235 (GKKH).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 15 مل مخروطي | فيشر Scientific | 14-959-49D | بروتوكول الخطوة 1.1. |
| بروتوكول BEGM | Lonza | CC-3170 | الخطوة 1.1. |
| بنسلفانيا / البكتيريا / مبيدات | لتقنيات الحياة | 15240-062 | بروتوكول الخطوة 1.1. |
| Penn / Strep | Life Technologies | 15140-122 | بروتوكول الخطوة 4.أ. |
| فرشاة علم الخلايا السيتوسوفتية | فيشر Scientific | 22-263-357 | بروتوكول الخطوة 1.2. |
| تريبان الأزرق | فيشر Scientific | MT-25-900-CI | بروتوكول الخطوة 2.1. |
| مقياس الدم | فيشر Scientific | 02-671-54 | بروتوكول الخطوة 2.1. |
| بروتوكول PBS | Fisher Scientific | BP2438-4 | الخطوة 2.2. |
| مقاطع قمع علم الخلايا | فيشر العلمي | 10-357 | بروتوكول الخطوة 2.2. |
| قمع السيتوبين | فيشر العلمي | 23-640-320 | بروتوكول الخطوة 2.2. |
| Cytospin 4 | بروتوكول A78300003 العلمي فيشر | الخطوة 2.2. | |
| شريحة فارغة | فيشر Scientific | S95933 | بروتوكول الخطوة 2.2. |
| مجموعة بقع هيما 3 | فيشر Scientific | 22-122-911 | بروتوكول الخطوة 2.2. |
| الكولاجين الجلدي البقري ، النوع 1 | الحياة | A1064401 | بروتوكول الخطوة 3.2. |
| قارورة T25 | فيشر Scientific | 08-772-45 | بروتوكول الخطوة 3.3. |
| التربسين | لونزا | CC-5012 | الخطوة 5.2. |
| حل تحييد التربسين | بروتوكول Lonza | CC-5002 | الخطوة 5.2. |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، معقم بالحرارة عند 65 درجة ؛ C لمدة 30 دقيقة | Sigma-Aldrich | F2442 | الخطوة 5.5. |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد Hybri-Max & trade ؛ ، مصفى معقم ، كاشف حيوي ، مناسب للورم الهجين ، & ge ؛ 99.7٪ | Sigma-Aldrich | D2650 | الخطوة 5.5. |
| polycistonic lentivirus * | على سبيل المثال < / em> Millipore | SCR511 | بروتوكول الخطوة 6.4. ؛ يتم سرد مصدر تجاري لإعادة برمجة المتجه. نحن نستخدم بشكل روتيني البلازميد 4 في 1 الذي أبلغ عنه Voelkel et al (PMID: 20385817) لتوليد فيروس العدسات العصبي VSV-G-pseudotyped polycistronic في المنزل. يمكن الحصول على هذا البلازميد عن طريق الاتصال ب |
| بوليبرين | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | SC-134220 | بروتوكول الخطوة 6.4. |
| CF1 MEFs | المشع GlobalStem | GSC-6301G | الخطوة 6.4. |
| وسائط hESC | انظر الوصفة المضمنة في | بروتوكول الخطوة 6.11. | |
| SB431542 | 6.11 لبروتوكول Stemgent | 04-0010 | |
| PD0325901 | 6.11 لبروتوكول Stemgent | 04-0006 | |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | البروتوكول الخطوة 6.11. |
| 6.13 | المؤهلة من hESC Matrigel | BD Biosciences | 354277 |
| لوحة كورنينج ، 6 آبار | فيشر ساينتفيك | 08-772-1B | بروتوكول الخطوة 6.13. |
| mTeSR1 | StemCell | 5850 | الخطوة 6.13. |
| قارورة فلتر 250 مل يمكن التخلص منها (0.22 وميكرو ؛ م) | فيشر | SCGP-U02-RE | |
| تباعد | StemCell | 7923 | الخطوة 7.3. |
| DMEM / F12 | Life Technologies | 11320-033 | بروتوكول الخطوة 7.3. |
| رافع الخلايا | فيشر Scientific | 08-100-240 | بروتوكول الخطوة 7.4. |
| hESC Media ** | خطوة البروتوكول 6.11. ثم تعقيمها بالترشيح. يمكن الاحتفاظ بالوسائط عند 4 درجات ؛ ج لمدة تصل إلى أسبوعين. عند تسخين وسائل الإعلام ، لا تترك عند 37 درجة ؛ C أطول من 15 دقيقة | ||
| DMEM-F12 50/50 وسائل الإعلام | Invitrogen | 11330-032 | نهائي |
| KO بدائل المصل (KO-SR) | Invitrogen | 10828-028 | 0.2 |
| 200 mM L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1 mM |
| 55 mM ß-mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | 0.1 mM |
| 100x الأحماض الأمينية غير الأساسية | Invitrogen | 11140-050 | 1x |
| 2 & micro; جم / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (b-FGF) | Invitrogen | 13256-029 | 4 نانوغرام / مل |
المراجع
- Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cells: past, present, and future. Cell stem cell. 10 (6), 678-684 (2012).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
