의 역할의 꿈틀 운동성의 시각화 및 특성<em&gt; PilG</em&gt;에서<em&gt; Xylella의 fastidiosa</em

요약

본 연구에서는 나노 미세 유체 흐름 챔버는 시각화 기능 Xylella fastidiosa, 포도 나무에 피어스의 질병을 일으키는 세균의 꿈틀 운동의 특성을 사용 하였다.

초록

Xylella fastidiosa의 식물의 경제적으로 중요한 질환들을 유발하는 그람 - 음성 박테리아 이외 flagellated이다. 꿈틀 운동성은 X를 제공합니다 fastidiosa 장거리 내 공장 이동 및 정착을위한 수단이 X에서 병원성으로 기여 X의 fastidiosa. 꿈틀 운동 fastidiosa는 타입 IV의 필리 운영하고 있습니다. Xylella의 fastidiosa의 유형 IV의 필리는 pilG, 신호 전달 경로에 관여하는 필-순찰대 오페론 인코딩 단백질의 화성 조절기에 의해 조절된다. X의 꿈틀 운동에 pilG의 역할을 규명하려면 fastidiosa하는 pilG 결핍 돌연변이 Xf를 ΔpilG 및 기본 pilG을 포함하는 그것의 보완 변형 XfΔpilG- C가 개발되었다. 타임 랩스 영상 녹화 시스템과 통합 마이크로 유체 챔버 XfΔp 경련 운동성을 관찰하는 데 사용ILG, XfΔpilG- C와 야생형 균주. 이 기록 장치를 사용하여, 장기 시공간 응집 관측 각 셀 및 경련 운동성 통해 박테리아 집단의 이동을 허용한다. X. 돌연변이 XfΔpliG는 연축 결핍 표현형을 나타내 fastidiosa 반면 야생형과 상보 XfΔpilG- C 균주 직접 미세 유동 챔버 관찰 전형적인 경련 운동성 특성을 보였다. 이 연구는 pilG는 X의 꿈틀 운동성에 기여하고 있음을 보여줍니다 fastidiosa. 마이크로 유체 유동 챔버 경련 운동성을 관찰하는 수단으로 사용된다.

서론

Xylella의 fastidiosa가 포도에서 피어스 질환 (비 티스 VINIFERA L.) ^{1, 2, 3을} 포함하여 경제적으로 중요한 작물 질환들을 유발하는 그람 - 음성 비 flagellated 병원성 박테리아이다. 이는 박테리아 물 전도성 목부에 한한다 선박. 소문의 감염은 목부의 선박과 물 부족의 결과와 영양 결핍 ^(3)의 막힘이 발생합니다. 성공적인 정착 식물 ^(3)의 나머지 감염의 초기 위치에서 이동하는 박테리아의 능력에 달려있다. X. 특징으로 한 극성 타입 IV의 필리 ^(4)의 연장, 첨부 한 후퇴 통해 편모 독립적 박테리아 이동 수단이되어 운동성 경련 fastidiosa ^5,6,7.

경련 운동성 레이저 핀셋 및 원자 힘 현미경 (AFM) ^8,9,10에 의해 관찰되었다. 이러한 기술을 이용하여 t매혹적인의 motilities는 N.의 유형 IV의 pilus에 의해 생성 임질과 P. 녹농균은 플로리다 uorescently 라벨 필리 현미경으로 그들의 움직임을 포착 특징으로했다. 두 방법은 개별 박테리....

프로토콜

1. 세균 콜로니의 주위 프린지

1. X를 성장 fastidiosa (Xf를) 테메 큘라 야생형 ^(22), pilG 삭제 돌연변이 PD2 매체 한천 플레이트 ^25에서 28 °에 (이전에 염색체 기반 유전자 보완 전략 ⁽²⁴⁾ 기술 사용) (이전에 설명한 삭제 전략 ^(23)를 사용하여) Xf를 ΔpliG, 그 보완 XfΔpliG -C 5~7일에 대한 C.
2. 15 분 동안 121 ° C (249 ° F)에서 물에 오토 클레이브 셀로판 (1 × 1cm ^2). , 셀로판의 한 조각을 들고 빈 페트리 접시에 셀로판의 한 구석을 터치하여 물기를 조심스럽게 한천 표면과 공기 건조의 15 % 이상 셀로판을 배치합니다.
3. 개별 X를 데리러 무균 한천 플레이트에 한천 표면의 15 %에 중첩 셀로판의 살균 장에 둥근 이쑤시개와 자리 세포 멸균와 fastidiosa 식민지. 접시를 품어2-3 일 동안은 28 ℃에서의.
4. 2 배 대물 렌즈와 해부 현미경 10 배 접안 렌즈를 사용하여 식민지의 가장자리의 형태를 검....

결과

IV 형 pilus 매개 경련 운동성을 나타내는 콜로니 주변 무늬의 존재는, X의 콜로니가 관찰되었다 fastidiosa 야생형 및 보완 Xf를 ΔpliG -C 변형 (그림 1). 돌연변이 XfΔpliG 그러나, 콜로니 주변부 프린지를 (도 1)을 나타내지 않았다. 나노 미세 유체 흐름 챔버에 박테리아 세포의 시간 경과 영상은 꿈틀 운동이 모두 야생형 X에서 관찰되었다 것으로 나타났다 fastidiosa 및 보완 XfΔpliG -C (기업 V1, V3)는 XfΔpilG 돌연변이 세포 반면 실험 (기업 V2)를 통해 운동성을 꿈틀 나타내지 않았다. 돌연변이 XfΔpilG의 세포 PD2 국물 (기업 V2)에 상대적으로 작은 느슨한 집합체를 형성했다.

토론

본 연구에서는 X의 모션 동작을 특징으로하는 fastidiosa PilG 돌연변이 Xf를 ΔpilG와 새롭게 디자인 된 다수의 병렬 나노 채널 마이크로 FL uidic 챔버에서의 보완 XfΔpilG- C 균주. 새롭게 디자인 된 마이크로 FL uidic 챔버는 하나의 50 μm의 넓은 채널 ^(18)과 이전 디자인에 비해 폭이 100 μm의 나노 채널과 최대 4 개의 병렬 챔버를 가질 수 있습니다. 개선 된 넓은 나노 채널은 미디어 흐르는 균체의 도입을 용이하게한다. 또한,이 마이크로 유체 챔버 구축하고 조립) 간단한 일이고; 2) 상대적으로 저렴; 3) 실험 요구 사항 변화에 쉽게 적용. 그 결과,이 챔버 설계 품종 하의 박테리아 세포의 움직임의 장기간 관찰 실험 미세 환경을 허용한다.

전류 throu의 흐름 FL 안정화GH 마이크로 FL 채널 uidic 실험 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Biology materials
X. fastidiosa (Xf) Temecula wild type			Costa, H. S., et al., 2004 22
>pilG deletion mutant XfΔ pliG			Shi, X. Y., et al., 2007 26
pilG 상보적 변형주 XfΔ pliG-C			Davis, M. J., et al. 1998 23
물리적 재료 및 장비
Disposable inoculating loops	VWR international, Radnor, PA	#22-363-607	세균 수집과 같은 정량적 절차
폴리디메틸실록산(PDMS)	Dow Corning Corporation	#0002709226	Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트
AmScope MD2000 디지털 카메라	AmScope, Irvine, CA	SE305R-AZ-E	이미지, 비디오 녹화 및 측정
튜브 라인	Edgewood, NY		주사기 및 미세유체 챔버에 연결
플라스틱 루어 커넥터	Edgewood, NY		주사기 및 미세유체 챔버에 연결
주사기 펌프	Pico Plus, Harvard Apparatus, MA#	702209	펌프가 작동하는 동안 유량을 조정할 수 있습니다.
Syringes	Gastight, Hemilton Company, Reno, NV	# 1005	흐르는 국물 제공
거꾸로 된 올림푸스 IMT-2 현미경	올림푸스	IMT-2 FLuoro PHase	이미지 관찰 및 기록
SPOT-RT 디지털 카메라	Diagnostic Instruments, Inc., MI	RT230	이미지, 비디오 기록 및 측정
현미경 셔터	UNIBLITZ, US < / em>	#LS2T2	제어 카메라' s 노출 시간
현미경 셔터 제어 시스템	UNIBLITZ, US	VCM-D1	VCM-D1 VCM-D1 단일 채널 CE/UL/CSA 승인 셔터 드라이버
MetaMorph 이미지 소프트웨어	Universal Imaging Corp., PA		실시간 초고해상도 이미지 처리

#T4300