Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

Ji-Yong Kang; Daichi Kawaguchi; Lei Wang

doi:10.3791/53818

Method Article

Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

DOI:

10.3791/53818

⸱

March 28th, 2016

Ji-Yong Kang¹ , Daichi Kawaguchi² , Lei Wang³

¹Department of Neuroscience, School of Medicine, Tufts University, ²Molecular Neurobiology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, ³Department of Pharmaceutical Chemistry and the Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлена процедура селективной активации нейронального белка коротким импульсом света путем генетического кодирования фотореактивной неестественной аминокислоты в целевой нейронный белок, экспрессируемый в нейронах в культуре или in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Фотостимуляция — это неинвазивный способ управления биологическими событиями с превосходным пространственным и временным разрешением. Необходимы новые методы фоторегуляции эндогенных белков, экспрессируемых в их родной среде. В этой статье мы представляем подход к оптическому контролю функции нейронного белка непосредственно в нейронах с помощью генетически кодируемой неестественной аминокислоты (Uaa). Используя ортогональную пару тРНК/аминоацил-тРНК-синтетаза для подавления янтарного кодона, фотореактивный Uaa 4,5-диметокси-2-нитробензилцистеин (Cmn) сайт-специфически встраивается в пору нейронального белка Kir2.1, внутренне выпрямляющего калиевой канал. Громоздкий Cmn физически блокирует пору канала, делая Kir2.1 непроводящим. Световое освещение мгновенно преобразует Cmn в более мелкую естественную аминокислоту Cys, активируя функцию канала Kir2.1. Мы экспрессируем эти p-хото-индуцируемые инаправленно ректирующиекалиевые (PIRK) каналы в первичных нейронах гиппокампа крыс и демонстрируем, что световая активация PIRK прекращает нейронное возбуждение из-за оттока тока K+ через активированные каналы Kir2.1. Используя внутриутробную электропорацию, мы также экспрессируем PIRK в эмбриональном неокортексе мыши in vivo, демонстрируя световую активацию PIRK в нейронах неокортекса. Генетически кодирующая Uaa не накладывает ограничений на тип целевого белка или клеточное расположение, и семейство фотореактивных Uaas доступно для модуляции различных природных аминокислотных остатков. Таким образом, этот метод может быть широко применен ко многим нейронным белкам для достижения оптической регуляции различных процессов в мозге. Текущий протокол представляет собой доступную процедуру для сложного встраивания Uaa в нейроны in vitro и in vivo для достижения фотоконтроля активности нейронных белков на молекулярном уровне.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

По сравнению с обычной электрической стимуляции, фотостимуляции обеспечивает большую временное и пространственное разрешение с минимальным вмешательством в физиологической системе образцов. Так как демонстрации использования лазеров для стимуляции нейронов в 1971 году ^1, многие творческие пути были изобретены , чтобы экзогенно контролировать активность нейронов с помощью света. Оптический выпуск photocaged агонистов уже давно используется для изучения физиологической реакции нейронной сети для лигандов ^2,3,4. Этот метод имеет ограниченную специфичность за счет диффузии проарретированных агонистов. Генетическая специфичность достигается за счет э....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры в данном исследовании были проведены с использованием Institutional Уход за животными и использование комитета (IACUC) утвердил протоколы для обработки животных на Солка института биологических исследований, La Jolla, CA.

1. Uaa Включение в Kir2.1 и экспрессия результирующей Pirk в первичной культуре нейронов

ДНК Строительство
1. Выберите целевой сайт Kir2.1 для UAA включения. Exploit предварительных знаний и информации о структуре и функции Kir2.1, так что выбранный сайт с фоточувствительных UAA Инкорпорейтед позволяет оптической модуляции Kir2.1 функции ^21.
2. Построить рекомбинантный ген....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы генетически включать UAA в белок в нейронах, первый важный шаг для разработки соответствующих генных конструкций для доставки и эффективно экспрессировать гены в нейронах. Существуют три генетические компоненты для UAA включения: (1) ген-мишень с тэгом янтарный стоп-кодон, введенной в выбранном месте для UAA включения (2) ортогональная тРНК признать мутировавший TAG стоп-кодон, и (3) ортогональный аминоацил -tRNA синтетазы для зарядки UAA на ортогональное тРНК. Каждый ком.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для достижения эффективного фото-модуляции, важный начальный шаг должен решить, где включить фоточувствительных UAA в белка-мишени. Структурно-функциональная информация целевого белка очень полезно, чтобы служить ориентиром при выборе возможных участков. В то же время, цель Светорегулирование бы определить, какой сайт является наиболее подходящим. После выбора кандидатов сайтов, мы рекомендуем , чтобы проверить сайты в клеточных линиях млекопитающих , таких как эмбриональной почки человека (НЕК) клеток для облегчения ку.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора С. Соботу за полезную дискуссию о культуре нейронов и трансфекции Ca-P. Л.В. выражает благодарность за поддержку со стороны The Salk Innovation Grant, Калифорнийского института регенеративной медицины (RN1-00577-1) и Национальных институтов здравоохранения (1DP2OD004744).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
Чехол Очки, круги, 12 мм, толщина 0,13-0,17 мм	Carolina Biologicals	633029
Corning BioCoat Poly-D-лизин	Corning Discovery Labware	354210
D-(+)-раствор глюкозы	Sigma-Aldrich	G8769
Ирис Шпатель	изогнутый Fine Science Tool	10092-12
Нож для препарирования - тонкий угловой кончик	Fine Science Tool	10056-12
GlutaMAX-I Supplement	Life Technologies	35050-061
MITO+ Усилитель сыворотки	BD Biosciences	355006
Falcon 40 µ m Клеточный фильтр	Corning Life Sciences	352340
BES (N,N-Bis(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновая кислота, N,N-Bis(2-гидроксиэтил)таурин)	Sigma-Aldrich	B6420
СВЕТОДИОДНЫЙ ИСТОЧНИК СВЕТА – Черный светодиод 385	Prizmatix Ltd.
Агароза, низкая температура плавления, аналитический класс	Promega	V2111

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fork, R. L. Laser Stimulation of Nerve Cells in Aplysia. Science. 171 (3974), 907-908 (1971).
Callaway, E. M., Katz, L. C. Photostimulation using caged glutamate reveals functional circuitry in living brain slices. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Оптический контроль нейронального белка с использованием генетически кодируемой искусственную аминокислоту в нейронах

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles