Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.
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Artigo de método
Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células dendríticas (CDs) são células apresentadoras de antigénios profissionais primariamente responsável pela aquisição, processamento e apresentação de antigénios no antigénio que apresenta moléculas para iniciar a imunidade mediada por células-T. As células dendríticas podem ser separados em vários subconjuntos fenotipicamente e funcionalmente heterogéneas. Três subconjuntos importantes de células dendríticas esplênicas são plasmocit�des, as células CD8a POS e CD8a Neg. As DCs plasmocitoides são produtores naturais de interferão de tipo I e são importantes para a imunidade de células T anti-viral. O subconjunto de CD8a Neg DC é especializado para apresentação de antígenos MHC classe II e está envolvido no centro de priming células T CD4. O CD8a Pos DCs são os principais responsáveis para a apresentação cruzada de antígenos exógenos e priming células T CD8. As DCs CD8a Pos ter sido demonstrado ser mais eficaz na apresentação de antigénios de glicolípidos por moléculas CD1d a um cel t especializadol população conhecidas como células invariante natural killer T (iNKT). A administração de ligando Flt-3 aumenta a frequência de migração de células progenitoras de células dendríticas a partir da medula óssea, resultando em última análise, a expansão de células dendriticas em órgãos linfóides periféricos em modelos murinos. Temos este modelo adaptado para purificar grandes números de células dendríticas funcionais para utilização em experiências de transferência de células para comparar proficiência in vivo de diferentes subconjuntos de DC.
Introdução
As células dendríticas (DC) foram descobertos há quase quarenta anos como o "grande estreladas celular (dendron grego)" encontrado nos órgãos linfóides 1. Muitos estudos têm demonstrado que DC são as únicas células que apresentam o antigénio que pode estimular eficazmente células T ingénuas 2. Uma das principais funções destas células é a absorção de antigénios e apresentação e o seu processamento eficiente e carregamento destes para moléculas que apresentam antigénios. No baço de ratinho, as DCs pode ser separado em subconjuntos e plasmocit�des convencionais. As DCs plasmocitoides são caracterizados por uma baixa expressão de CD11c e....
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Protocolo
Experiências em animais são feitos de acordo com as directrizes aprovadas do comitê institucional cuidados com os animais e uso (IACUC). Todos os procedimentos que requerem a esterilidade são realizadas em uma cabine de segurança biológica.
1. Implantação de Melanoma B16.Flt3L em Ratos
- Cultura da linha expressando Flt-3 de células de melanoma B16 em frascos de cultura de tecidos T25, a uma densidade de 0,5 X 10 6 células / ml em meio DMEM completo com 10% de CO 2 a 37 ° C. Crescer até as células atingirem confluência ~ 90% (~ 20 h).
- Colher as células por digestão com tripsina. Aspirar os meios de....
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Resultados
O resultado deste procedimento baseia-se na ampliação de subconjuntos de DC de murino por Flt-3L expressos pelas células de melanoma implantado. O tumor B16.Flt3L foi derivado a partir de um ratinho C57BL 6 /, e deve ser implantado num animal com essa estirpe de fundo, a fim de evitar o fracasso do tumor para se estabelecer devido à rejeição. Em alguns casos, pode ser desejável a utilização de ratinhos geneticamente modificados para derivar as DCs com defeitos conhecidos nas vias de sina.......
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Discussão
As células dendríticas são aceites como sendo a principal antigénio profissional células envolvidas na iniciação de respostas de células T apresentando. Sua função principal é fazer um levantamento do microambiente do tecido, tomando-se e processar antigénios para apresentação às células T. A fim de estudar a função dos subconjuntos de DC específicos, estes devem ser isolado em quantidade suficiente usando uma abordagem que mantém o seu fenótipo e funções normais. A maioria dos protocolos contar com o isolamento de DC s.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIAID AI45889 subvenção para SAP citometria de fluxo estudos foram realizados utilizando as instalações nucleares FACS apoiados pelo Cancer Center Einstein (NIH / NCI CA013330) e Center for AIDS Research (NIH / NIAID AI51519).
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Materiais
Serum free DMEM e RPMI media
com 70% de etanol Instrumentos Científicos Sistema de filtração a vácuo Placas de 96 poços de fixação ultrabaixa 111623 celular de melanoma Jax 500 ml DMEM com L-glutamina, ou 500 ml RPMI-1640 com L-glutamina5 ml de aminoácidos não essenciais MEM (100x,Misture todos os ingredientes em um gabinete de biossegurança com mídia DMEM ou RPMI,
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% de tripsina-EDTA | Life Technologies, Gibco | 25300-054 | |
| Isoflurano | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| Colagenase D | Roche Diagnostics | 11088858001 | |
| DNase I (pó seco) | QIAGEN | 79254 | |
| Etanol à prova de 200 | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | Usado para preparar |
| tampão de lise de RBC | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| RPMI-1640 médio com L-glutamina | Life Technologies, Gibco | 11875-119 | |
| Meio DMEM com L-glutamina | Life Technologies, Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-glutamina | Life Technologies | 25030081 | |
| aminoácidos não essenciais MEM | Life Technologies, Gibco | 11140-050 | |
| MEM aminoácidos essenciais | Tecnologias de Vida | 11130-051 | |
| β-mercaptoetanol | Life Technologies, Invitrogen | 21985-023 | |
| Piruvato de sódio | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies, Invitrogen | 15630 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS Ca2+ e Mg2+ pH livre 7.2) | Life Technologies, Invitrogen | 20012-050 | |
| Dulbecco' s PBS (DPBS com Ca2+ e Mg2+) | Life Technologies, Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M Solução de etilenodiaminotetraacetato (EDTA) | Life Technologies | 15575-020 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Soro fetal para bezerros | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| Penicilina/estreptomicina | Life Technologies, Invitrogen | 15140-163 | |
| Trypan blue (pó seco) | Sigma-Aldrich | T6146-5G | Prepare 0,08% com PBS |
| Kit de Isolamento de Células Dendríticas Plasmocitoides II, camundongo | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| Contas magnéticas conjugadas com CD11c anti-camundongo; | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8α Kit de isolamento DC de mouse Pos | Miltenyi Biotech | 130-091-169 | |
| Anticorpo bloqueador do receptor Fc-gama (Clone 2.4G2) | BD Biosciences | 553141 | |
| Anti-mouse CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| Anti-mouse CD8&alfa;-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| Anti-mouse B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| Seringas de 1 ml | BD | 26048 | |
| 23 G1 agulha | BD | 305145 | |
| placas de Petri de 100 mm | 875712 | Cirúrgicos Thermo Fisher | |
| Kent Scientific | INSMOUSEKIT | ||
| Filtro de células (70 µ m) | BD | 352350 | |
| Grandes placas de Petri | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| (500 ml (0.22 µ m)) | Corning | 431097 | |
| colunas LS | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Separador MACS com suporte magnético | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Wide-bore 200 μ l pontas de pipeta | PerkinElmer | ||
| Corning | Corning | CLS3474-24EA | |
| camundongos C57BL/6 fêmeas de 6-8 semanas de idade | Jackson Research Laboratories, linhagem | ||
| Murine B16.Flt3L | descrita por Mach et al., 2000 | ||
| 10 mM) Tampão HEPES de 5 ml (1 M) 5 ml de L-glutamina (200 mM) 0,5 ml de 2-mercaptoetanol (5,5 x 10-2 M) | dependendo da sua necessidade. Filtre esterilize a mídia passando por um 0,22 µ Sistema de filtragem a vácuo M. | ||
| Meios RPMI e DMEM completos | Adicione 50 ml de soro fetal de bezerro inativado pelo calor ao meio RPMI ou DMEM livre de soro para obter um meio completo. | ||
| MACS | Adicione 2 ml de EDTA 0,5 M e 10 ml de soro fetal de bezerro inativado pelo calor a 500 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, Ca2+ e Mg2+ Free, pH 7,2) e 2 µ g/ml 2,4G2 (anticorpo Fc-Block). | ||
| Tampão de coloração FACS | Dissolva a azida sódica a 0,05% (0,25 g por 500 ml) em tampão MACS para obter tampão de coloração | ||
| FACS10x solução estoque de colagenase D e DNase 1 Dissolva 1 g de colagenase D e 0,2 ml de estoque de DNase 1 (1 mg / ml, 100x) em 20 ml de PBS contendo Ca2+ e Mg2+ para obter uma solução de aproximadamente 1.000-2.000 unidades de atividade da colagenase por ml. | Esta solução estoque de 10x pode ser preparada com antecedência e armazenada a -20 &graus; C por várias semanas. Diluir 1 ml com 9 ml de RPMI livre de soro imediatamente antes da utilização. |
Referências
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control ....
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Reimpressões e permissões
