نصف بروتوكولا لتضخيم مواقع تكامل الفيروسات القهقرية من الحمض النووي الجيني للخلايا المصابة ، وتسلسل تقاطعات الفيروس المضيف المضخمة ، ثم تعيين هذه التسلسلات إلى جينوم مرجعي. نصف أيضا تقنيات لتحديد توزيع مواقع التكامل بالنسبة للتعليقات التوضيحية الجينومية المختلفة باستخدام BEDTools.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التضخيم، الجيل التالي من التسلسل، والحمض النووي الجينوم رسم خرائط مواقع التكامل فيروسات الرجعية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الفيروسات القهقرية معرض تفضيلات التكامل التوقيع على كل من المستويين المحلي والعالمي. هنا، نقدم بروتوكول مفصل ل(1) جيل من مكتبات متنوعة من مواقع التكامل فيروسات باستخدام PCR (LM-PCR) والتضخيم بوساطة ربط وتسلسل الجيل التالي (خ ع)، (2) رسم خرائط الموقع الجيني لكل virus- تستضيف ملتقى باستخدام BEDTools، و (3) تحليل البيانات الإحصائية لأهميتها. تجزئة الحمض النووي الجيني المستخرجة من الخلايا المصابة عن طريق الهضم مع الانزيمات تقييد أو صوتنة. بعد مناسبة الحمض النووي نهاية إصلاح، و تربط linkers المزدوج تقطعت بهم السبل على نهايات الحمض النووي، ويجري شبه متداخلة PCR باستخدام بادئات التكميلية لكل من طويلة تكرار محطة (LTR) نهاية الفيروس والحمض النووي رابط ligated. الاشعال PCR تحمل متواليات اللازمة لتجميع الحمض النووي خلال NGS، يلغي الحاجة إلى ربط محول منفصل. وتجري مراقبة الجودة (QC) لتقييم تفتيت الحمض النووي حجم التوزيع والتكيفإيه التأسيس الحمض النووي قبل خ ع. يتم تصفيتها ملفات الإخراج تسلسل LTR التي تحتوي يقرأ، وتسلسل تحديد LTR ورابط واقتصاص بعيدا. يتم تعيين قلص تسلسل الخلية المضيفة لجينوم مرجع باستخدام بلاط ويتم تصفيتها عن الهوية الحد الأدنى 97٪ إلى نقطة وحيدة في الجينوم المرجعية. هي تمحيص مواقع التكامل فريدة من نوعها لالنوكليوتيدات المجاورة (الإقليم الشمالي) تسلسل والتوزيع النسبي لمختلف الخصائص الجينومية. باستخدام هذا البروتوكول، مكتبات موقع تكامل عالية التعقيد يمكن بناؤها من الحمض النووي الجيني في ثلاثة أيام. وبالتالي يمكن إجراء بروتوكول بأكمله الذي يشمل التهاب فيروسي خارجي من خلايا نسيج الثقافة عرضة للتحليل الموقع التكامل في ما يقرب من 1-2 أسابيع. التطبيقات الحديثة لهذه التكنولوجيا تتعلق التحليل الطولي للمواقع التكامل من المرضى المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية.
المقدمة
دمج الحمض النووي الفيروسي (vDNA) في الجينوم الخلية المضيفة خطوة أساسية في دورة حياة فيروس. ويتم إنجاز التكامل من إنزيم مدمج الإنزيم الفيروسي (IN)، التي تنفذ عمليتين الحفازة متميزة تؤدي إلى إنشاء طليعة الفيروس إدراج مستقر 1. في مفارز إشراك طرفي vDNA الخطية التي يتم إنشاؤها من خلال النسخ العكسي، وتشكيل intasome العليا مع vDNA ينتهي عقد معا من قبل في متعدد القسيمات 2-4. في يشق 'ينتهي من vDNA المصب من 5'-CA-3 ثابتة "3 تسلسل في عملية تعرف باسم 3'معالجة تاركة راحة 3" ينتهي مع مجموعة الهيدروكسيل على رد الفعل في كل vDNA النهاية 5-8. يتم استيراد intasome في وقت لاحق الى نواة كجزء من التجمع كب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. توليد مخزونات فيروس
ملاحظة: وصفت مخطط تدفق الجانب مقاعد البدلاء الرطب من هذا البروتوكول في الشكل 1 وتفاصيل إنتاج الأسهم الفيروسية والعدوى لاحق من خلايا نسيج الثقافة ينطبق عموما على أنواع مختلفة من الفيروسات. بالنسبة لبعض التجارب، والخلية المستهدفة قد لا تعبر عن مستقبلات الفيروسية الذاتية (ق)، وفي مثل هذه الحالات بناء جزيئات فيروس pseudotyped إيواء مغاير الفيروسي بروتين سكري مغلف، مثل بروتين سكري G من فيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G)، سيكون مطلوب للعدوى 44،45.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الجدول 4 قوائم نتائج تجربة تمثيلية لتوضيح حساسية خ ع لاستعادة مواقع التكامل من ثقافة الخلايا المصابة. تم استخدام الحمض النووي الخلوي غير مصاب لتمييع متسلسل الحمض النووي الجيني من عدوى فيه كل خلية في المتوسط تحتوي على التكامل واحد 40. تم إعداد التخفيفات في الخطوات من خمس إلى التخفيف إلى أقصى حد من 1: 15625. الحمض النووي الجيني في سلسلة المعايرة ثم تجزئة صوتنة أو عن طريق الهضم مع تقييد نوكلياز داخلي MseI وBglII، تليها LM.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بروتوكول لتحليل مواقع التكامل فيروسات، من الخطوة عدوى فيروس الأولية من خلال رسم خرائط لأنماط توزيع الجينومية، وصفت. هذا البروتوكول ينطبق على أي الارتجاعي وأي نوع من الخلايا مصابة. وعلاوة على ذلك، فإن خط الأنابيب فحص حساس جدا، مع القدرة على استعادة عدد كاف من مواقع التكامل فريدة من التخفيفات المسلسل يعادل الحمض النووي الجيني إلى أن عدوى بدأت مع وزارة الداخلية من 6.4 × 10 -5. هذه الحساسية يجعل بروتوكول مفيدة بشكل خاص عند تطبيقه على عينات من المرضى المصابين التي قد تحتوي ع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون لزملائنا ستيفن هيوز وهنري ليفين للحصول على المشورة التي كانت حاسمة لوضع بروتوكول NGS للفيروسات موقع التكامل التسلسل في المختبر Engelman. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة منح AI039394 وAI052014 (لمتفجرات نترات الأمونيوم) وAI060354 (مركز جامعة هارفارد للأبحاث الإيدز).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 11965-084 | وسط زراعة الخلايا القياسي ، متوافق مع الخلايا |
| HEK293T مصل الأبقار الجنيني | Thermo Scientific | SH 30088.03 | قد تحتاج كميات مختلفة من المصل إلى الفحص المسبق للحصول على الإنتاج الفيروسي الأمثل |
| البنسلين / الستربتومايسين | Corning | 30-002-Cl | المضادات الحيوية لإضافتها إلى DMEM |
| Phosphate-Frozen Saline | Mediatech | 21-040-CV | تستخدم لغسل الخلايا |
| التربسين EDTA | Corning | 25-053-CI | تستخدم لفصل الخلايا الملتصقة عن ألواح زراعة الأنسجة |
| PolyJet | SignaGen | SL100688 | كاشف تعداء الحمض النووي |
| 0.45 & micro ؛ م مرشحات | حراري علمي | 09-740-35B | تستخدم لتصفية وسائط زراعة الخلايا المحتوية على جزيئات الفيروس |
| Turbo DNase | Ambion | AM2239 | تستخدم لتحلل الحمض النووي البلازميد المرحل من مخزونات الفيروسات |
| HIV-1 p24 Antigen Capture Assay | ABL Inc. | 5447 | تستخدم لتحديد إنتاجية إنتاج الفيروس |
| DNeasy Blood & مجموعة الأنسجة | Qiagen | 69506 | تستخدم لتنقية الحمض النووي الجيني من الخلايا |
| Sonicator | Covaris | S2 | مع هذا النموذج من الصوتنة أداء جولتين من دورة العمل ، 5٪ ؛ الكثافة ، 3 ؛ دورات لكل انفجار ، 200 ؛ الوقت ، 80 ثانية |
| ماء Nuclease الخالي | من Nuclease GeneMate | G-3250-125 | يوصى بالمياه المتوفرة تجاريا لتقليل احتمالية التلوث المتبادل للعينة |
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | تستخدم لتنقية الحمض النووي أثناء بناء المكتبة |
| End-It DNA End-It End-Repair | Kit Epicenter | ER81050 | تستخدم لإصلاح نهايات الحمض النووي لعينات الحمض النووي الصوتية |
| Klenow Fragment (3'-5' exo –) | New England Biolabs (NEB) | M0212S | تستخدم مع dATP إلى شظايا الحمض النووي التي تم إصلاحها من A-tail |
| dATP | Thermo Scientific | R0141 | Deoxyadenosine triphosphate |
| MseI | NEB | R0525L | تقييد نوكلياز داخلي لانقسام الحمض النووي الجيني |
| BglII | NEB | R0144L | نوكلياز داخلي لقمع تضخيم تسلسل HIV-1 U5 |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202L / 6218 | إنزيم للانضمام التساهمي لنهايات الحمض النووي المتوافقة |
| DNA قليل النوكليوتيدات | تقنيات الحمض النووي المتكاملة | المخصصة | اطلب من الشركة تنقية oligos. تنقية HPLC كافية للحمض النووي < 30 نيوكليوتيدات PAGE تنقية الحمض النووي الأطول |
| ميزة 2 مزيج البوليميراز | Clontech | 639202 | مزيج تجاري يحتوي على بوليميراز الحمض النووي ل PCR |
| dNTPs (محاليل 100 ملم) | Thermo Scientific | R0181 | تمييع المواد الكيميائية الأربع الموجودة على الجليد بالماء المعقم للوصول إلى التركيزات الوسيطة البالغة 2.5 ملي مولار لكل مقياس |
| الطيف الضوئي dNTP NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | لتقدير تركيز |
| الحمض النوويQubit Fluorimeter | Life Technologies | Qubit & reg; 3.0 | مقياس الفلور المستخدم لتأكيد تركيز الحمض النووي لمكتبة موقع التكامل |
| 2200 نظام TapeStation | Agilent | G2964AA | الفحص القائم على الشريط لتأكيد توزيع حجم الحمض النووي لمكتبة موقع |
| التكامل MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | المستخدمة في NGS |
المراجع
- Craigie, R., Bushman, F. D. HIV DNA integration. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, a006890(2012).
- Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. J., Craigie, R. Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates. EMBO J. 25, 1295-1304 (2006).
- Hare, S., Gupta, S.....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
