عن طريق تجميع الحمض النووي، وناقلات كريسبر متعددة يمكن بناؤها بالتوازي في رد فعل الاستنساخ واحد، مما يجعل بناء أعداد كبيرة من كريسبر ناقلات مهمة بسيطة. الطماطم جذور شعر هي نظام نموذجا ممتازا للتحقق من صحة ناقلات كريسبر وتوليد مواد متحولة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أثبتت < p class = 'jove_content'> طفرات الحمض النووي المستهدفة الناتجة عن النواقل ذات التكرارات المتجانسة القصيرة المتباعدة بانتظام (CRISPR) / Cas9 أنها مفيدة لدراسات الجينوم الوظيفية. في حين أن معظم استراتيجيات الاستنساخ سهلة التنفيذ ، إلا أنها تستخدم عموما خطوات متعددة ويمكن أن تتطلب عدة أيام لإنشاء التركيبات النهائية. تعتمد الطريقة المعروضة هنا على تجميع الحمض النووي ويمكن أن تنتج نواقل كريسبر تعمل بكامل طاقتها في تفاعل استنساخ واحد. يمكن أيضا تجميع بناء النواقل ، مما يزيد من كفاءة العملية وفائدتها. يتم استخدام تعديل الطريقة لإنشاء نواقل كريسبر ذات أهداف جينية متعددة. ثم يتم تحويل نواقل كريسبر إلى جذور مشعرة للطماطم لتوليد مواد معدلة وراثيا مع تعديلات مستهدفة على الحمض النووي. تعتبر الجذور المشعرة نظاما مفيدا لاختبار وظائف المتجهات لأنها سهلة الإنشاء تقنيا وقابلة للإنتاج على نطاق واسع. سيكون للطرق المعروضة هنا تطبيق واسع حيث يمكن استخدامها لتوليد مجموعة متنوعة من نواقل كريسبر واستخدامها في مجموعة واسعة من الأنواع النباتية.
المقدمة
القدرة على توليد التعديلات الحمض النووي المستهدفة مع كريسبر / Cas9 لديها امكانات كبيرة لدراسات الجينوم وظيفية. هناك نوعان من مكونات كريسبر / نظام Cas9. ونوكلياز Cas9، والمستمدة من المقيحة المكورات العنقودية وجزيء ما يقرب من 100 الإقليم الشمالي دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) الذي يوجه Cas9 إلى الموقع الحمض النووي المستهدفة (ق) 1. وتمنح الاعتراف استهداف من قبل لأول مرة ~ 20 الإقليم الشمالي من gRNA، والذي يسمح لإنتاج عالية الإنتاجية من ناقلات تستهدف 2،3. معظم الكائنات الحية التي يمكن هندستها، وقد تم بالفعل مع كريسبر التكنولوجيا / Cas9 4،5.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. دليل الحمض النووي الريبي التصميم والبناء المتجهات
- تحديد تسلسل هدف للجينات الفائدة. وهناك مجموعة متنوعة من البرامج لتقصي الهدف كريسبر على الانترنت المناسبة لهذه الخطوة 13،14.
ملاحظة: هنا نستخدم GN 20 GG عزر الهدف، ولكن تصاميم أخرى قد تكون مناسبة وفقا لنظام تطبيق أو ناقلات المستخدمة. - تصميم 60-mer من oligos gRNA لتشمل الجزء GN 19 من الزخارف الهدف يحيط بها 5 'و 3' تسلسل 20 الإقليم الشمالي المطلوبة لتجميع الحمض النووي. النهائي عزر 60 مير هو: 5&....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كريسبر بناء ناقلات مع التجمع الحمض النووي يولد عادة عشرات إلى مئات من الحيوانات المستنسخة مستقلة. فحص مستعمرة من قبل PCR تحدد بسهولة استنساخ الصحيحة، ويمكن أن تميز بين البلازميدات مع وبدون تدرج (الشكل 2A) وهي مفيدة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. عادة، كل من الحيوانات المستنسخة تحتوي على إدراج ويمكن للمستخدم اختيار لتخطي الخطوات مستعمرة الفحص تماما. وتستخدم هضم التشخيص (الشكل 2B) وسانجر تسلسل لمراقبة الجودة. عندما لا تح.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نظرا لأن تجميع الحمض النووي يستخدم لإعادة تجميع أي تسلسلات متداخلة للحمض النووي ، يمكن تطبيق طريقة الاستنساخ هذه على أي بناء ناقل CRISPR. تستخدم معظم مخططات استنساخ كريسبر إما تخليق الجينات ل gRNA أو إنزيمات تقييد النوع IIS17،18 أو PCR19 المتداخل. كل من هذه التقنيات لها مزايا وعيوب متأصلة ، لكنها تتطلب عادة خطوات استنساخ عملية متعددة. الميزة الأساسية لطريقة الاستنساخ المعروضة هنا هي أن العملية برمتها تحدث في تفاعل واحد مدته ساعة واحدة ويمكن تجميع oligos gRNA لزيادة تبسيط إجراء الاستنساخ. علاوة على ذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذا البحث من قبل منحة المؤسسة الوطنية للعلوم IOS-1025642 (GBM). نشكر ماريا هاريسون لتوفير سلالة ARqua1.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| NEBuilder® (مزيج تجميع الحمض النووي HiFi) | New England Biolabs | E5520 | |
| p201N: Cas9 | Addgene | 59175 | يتوافق البلازميد p201H: Cas9 (59176) أيضا مع التداخلات والإنزيمات المبلغ عنها. |
| pUC gRNA Shuttle | Addgene | 47024 | |
| Swa< / em>I | New England Biolabs | R0604S | |
| Spe< / em>I | New England Biolabs | R0133S | |
| Zymo تنقية العمود النظيف والمكثف -5 | Zymo Research | D4003 | |
| NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B7202S | |
| NEB CutSmart (عازلة 4) | New England Biolabs | B7204S | |
| NEB Buffer 3.1 | New England Biolabs | B7203S | |
| EconoSpin Mini Spin Spin Column (البلازميد الإعدادي)Epoch | Life Sciences | 1910-050 / 250 | |
| EcoRV-HF & reg ؛ | نيو إنجلاند بيولابيس | R3195S | |
| StyI-HF & reg ؛ | أملاح نيو إنجلاند بيولابس | R3500S | |
| فيتامينات Gamborg | Phytotechnology | M404 | |
| Phytagel & trade ؛ (صمغ جيلان) | سيجما ألدريتش | P8169 | |
| GA-7 صناديق | سيجما ألدريتش | V8505 | |
| Micropore™ الشريط الجراحي | 3M | 1535-0 | |
| Timentin & reg ؛ (تيكارسيلين / حمض كلافولانيك) | مختلف | 0029-6571-26 | |
| الاشعال 5' → 3'SwaI_MtU6F | |||
| GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG | |||
| MtU6R | AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG | ||
| Scaf | GTTTTAGAGAGCTAGAAATAGC AAGTT | ||
| SpeI_Scaffold R | GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| StUbi3P218R | لا يمكن استخدام ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT | ||
| ISceIR | GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG | لتسلسل Sanger نظرا لوجود موقع ربط ثان على UNS1_Scaffold البلازميد | |
| R | GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG | ||
| UNS1_MtU6 F | CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG | ||
| p201R | تشير التسلسلات الجريئة CGCCCCGAATTCTAGTGATCG | ||
| إلى تداخلات 20-nt مع p201N: Cas9 الخطي. |
المراجع
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
