Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins

Published: May 29, 2016 doi: 10.3791/53847
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Cell and Molecular Biology, Chemical Physiology and Microbial Science, The Scripps Research Institute, 2Department of Medicinal Chemistry and Chemical Biology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

Abstract

فيروس الانفلونزا (IAV) hemagglutinins الاعتراف الأحماض اللعابي على سطح الخلية كما مستقبلات وظيفية للحصول على دخول الخلايا. الطيور المائية البرية هي المستودع الطبيعي لIAV، ولكن IAV يمكن عبور الحواجز القائمة بين الأنواع والدواجن والخنازير والخيول والبشر. فيروسات أنفلونزا الطيور تعترف الحامض اللعابي تعلق على اللبن قبل الأخير من الربط α2-3 (من نوع الطيور مستقبلات) في حين أن الفيروسات التي تصيب البشر تعترف تفضيلي الحامض اللعابي مع الربط α2-6 (النوع البشري مستقبلات). لمراقبة إذا فيروسات أنفلونزا الطيور والتكيف مع مستقبلات نوع الإنسان، عدة طرق يمكن استخدامها. تستخدم المجهرية غليكان مع مكتبات متنوعة من sialosides الاصطناعية على نحو متزايد لتقييم مستقبلات خصوصية. ومع ذلك، لا يتم استخدام هذه التقنية لقياس avidities. ويتحقق القياس من الطمع عادة من خلال تقييم ملزم من هيماغلوتينين تخفيفه بشكل متسلسل أو الفيروس إلى glycans كثف لمادة البولي بروبيلين لوحات 96-جيدا التقليدية. في هذا الاختبار، glycans مع αتقترن 2-3 أو α2-6 الأحماض اللعابي إلى البيوتين وكثف لوحات streptavidin، أو تقترن لبولي أكريلاميد (دوس) الذي كثف مباشرة على البلاستيك. لقد المنمنمة إلى حد كبير هذا الاختبار عن طريق طباعة مباشرة sialosides المرتبطة دوس ونظرائهم غير مرتبطة دوس على الشرائح الزجاجية جيدا الصغيرة. هذه مجموعة المتابعة، مع 48 المصفوفات على شريحة واحدة، تمكن فحوصات في وقت واحد من 6 غليكان ملزمة البروتينات في 8 التخفيفات، استجواب 6 glycans مختلفة، بما في ذلك عنصري تحكم غير sialylated. هذا هو ما يعادل 18X لوحات 96-جيدا في فحص لوحة التقليدي. شكل مجموعة غليكان يقلل استهلاك مركبات والبيولوجية، وبالتالي إلى حد كبير يعزز كفاءة.

Introduction

الطيور المائية البرية هي المستودع الطبيعي لIAV، ولكن IAV قادرة على عبور الحواجز القائمة بين الأنواع والدواجن والثدييات، بما في ذلك البشر. IAVs الطيور الاعتراف α2-3 الأحماض اللعابي المرتبطة (من نوع الطيور مستقبلات)، في حين أن الفيروسات التي تصيب البشر ربط α2-6 الأحماض اللعابي المرتبطة (من نوع البشري مستقبلات). لتكون قادرة على تكرار بكفاءة ونقل بين البشر والطيور IAV يحتاج إلى ربط الإنسان من نوع مستقبلات 1.

وتنقسم IAVs بناء على الأمصال التي تميز استضداد من هيماغلوتينين من (HA) والنورامينيداز (NA) بروتينات سكرية المغلف. HA يربط الأحماض اللعابي، في حين NA هو انزيم تدمير مستقبلات في الطرف الآخر من مراحل دورة حياة الفيروس ويشق الحامض اللعابي 2. جميع الفيروسات التي تصيب الإنسان، بما في ذلك H1N1، H2N2 و H3N2، لديهم أصل الطيور 3. على مدى الماضيين عقود عدة الطيور لعمليات الانتقال الإنسان وقعت، مع H5N1، H7N7، H7N9، وكونها الأكثر شهرة؛ هاوالاصدار، أنواع فرعية أخرى قد يصاب البشر أكثر بشكل متقطع (H6N1، H7N1، H7N2، H9N2، H10N7، H10N8) 4. لحسن الحظ، يبدو أن أيا من هذه الفيروسات تمكنت من التكيف تماما إلى نوع البشري مستقبلات الحامض اللعابي المرتبطة α2-6 5-8. التكيف من الفيروسات الحيوانية الطيور أو غيرها لاستيعاب تكرار ونقل في المضيف البشري يمكن أن يكون لها تأثير مدمر على صحة الإنسان. لذلك، علم مسبق كيف تتطور هذه الفيروسات لربط من نوع البشري مستقبلات سيساعد المراقبة في جميع أنحاء العالم من فيروسات الأنفلونزا المستجدة.

تقرير تفضيل مستقبلات تم توضيحها أولا باستخدام كرات الدم الحمراء من مختلف الأنواع وتبقى فحص المفضل بين الباحثين انفلونزا 9-12. المظاهرة التي فيروسات أنفلونزا الطيور تعترف الحامض اللعابي α2-3 والفيروسات التي تصيب البشر α2-6 يرتبط الحامض اللعابي كان في الأصل على أساس مقايسة باستخدام التراص من الكريات الحمراء المهندسة إنزيمي لاحتواء كل من لىnkages 13،14. على الرغم من أن قراءات هو التراص، فحص القياسي لالفيروسات، لا يتم تحديد الهياكل غليكان الأساسية، إلا أن الربط المحطة. بالإضافة إلى ذلك، توفر محدود للsialyltransferases، وتستخدم لإعادة sialylate-الخلايا، قد حدت من استخدام هذا الاختبار 15-18. وفي وقت لاحق، وأدخلت أساليب أخرى لتحديد تفضيلات ملزم مستقبلات باستخدام هياكل غليكان sialylated مرتبط بولي أكريلاميد (دوس) أو هياكل البولي الغلوتامات (PGA) في المقايسات القائم على لوحة 19،20. العديد من الاختلافات ممكنة في طلاء إما glycans أو الفيروسات إلى صفيحة معايرة دقيقة، كل منها يؤدي إلى قوي وموثوق بها وحساسة للغاية ELISA من نوع الفحص 21-23. بدلا من ذلك، يمكن glycans المرتبطة البيوتين محل دوس / PGA، ويمكن أن يضاف إلى لوحات streptavidin المغلفة 2،24. على الرغم من أن بعض الأمصال محددة قد تكون مطلوبة، ELISAs هي glycans القياسية وعدة مرتبطة دوس يتم بسهولة commerciallذ وغير المتاحة تجاريا (التجمع من أجل Glycomics الوظيفية (http://www.functionalglycomics.org)).

ظهرت تقنيات ميكروأري غليكان باعتبارها أداة لا تقدر بثمن لتحديد مستقبلات خصوصية، كما رصدت glycans مختلفة متعددة، وملزمة لمجموعة واسعة من الهياكل المختلفة يمكن تقييمها في فحص واحد 25-29. الربط من IAV لهذه الهياكل يوفر فهما أفضل للهياكل غليكان أن IAV تعترف تفضيلي 30-33. تتطلب ميكروأرس غليكان كميات صغيرة من حجم العينة لإجراء فحص ملزمة ويستخدم سوى كميات ضئيلة من غليكان في بقعة (2 NL). ومع ذلك، وعادة ما تستخدم هذه المصفوفات فقط لتقييم خصوصية glycans مستقبلات. تحليل الفيروسات متعددة، أو البروتينات راصة دموية، في نطاقات تركيز متعددة يمكن أن تكون باهظة نظرا لعدد من الشرائح المطلوبة. وعلاوة على ذلك، حتى الآن، وقد وضعت أي فحص الطمع النسبي باستخدام ع غليكانتقنيات الأشعة.

الجمع بين متطلبات عينة المنخفض التي تتيحها تقنيات ميكروأري غليكان وحساسية glycans المرتبطة دوس في المقايسات مقرها ELISA، سعينا إلى تطوير مجموعة متعددة جيدا غليكان التي من شأنها أن تسمح للتحليل إنتاجية عالية مع قرار مماثل أو أفضل مقارنة لفحص التقليدية القائمة ELISA. في وقت واحد، أردنا أن تقليل كمية المواد البيولوجية والكيميائية مراسل المستهلكة. والنتيجة النهائية هي فحص الطمع المنمنمة، وضعت خصيصا لرصد IAV خصوصية وقابلة للتطبيق على حد سواء لتقييم البروتينات ملزمة غليكان أخرى. باستخدام شريحة زجاجية فصلها إلى 48 بئرا الصغرى التي كتبها قناع تفلون، ورصدت 6 glycans مختلفة في 6 مكررات لكل بئر. منصة ميكروأري يعطي نفس الاتجاهات في مستقبلات ملزمة ينظر في شكل ELISA الكلي مع العديد من المزايا. وتشمل هذه (I) طباعة مجمع في 6 مكررات، وذلك باستخدام الحد الأدنى من العينة، مقابل طلاء من عدة صفوف طنا لوحة، وذلك باستخدام 100 ميكرولتر لكل بئر. (II) تحليل عدة مركبات مختلفة في وقت واحد في بئر واحدة، بما في ذلك الضوابط. (الثالث) إلى جانب النقص الهائل في حجم الحضانة و. (رابعا) مجموعة ديناميكية أكبر باستخدام قراءات الفلورسنت. ويمكن حساب شريحة واحدة ليكون معادلا ل18X لوحات 96-جيدا.

مع بروتوكول التالية، أي قادرة مختبر تصنيع وتحليل رصدت يجب المجهرية تكون قادرة على تصنيع هذا الشكل ELISA المنمنمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.

1. صفيف البناء

  1. إعداد غليكان وإعداد لوحة
    1. إعداد المخزون من المخزن الطباعة. تأكد أولا من 500 مل من حل 150 ملي الأسهم من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة. أيضا جعل 50 مل من حل 150 ملي الأسهم من أحادي القاعدة حل فوسفات الصوديوم. في قارورة، وذلك باستخدام بقضيب ودرجة الحموضة متر المغناطيسي، يعاير ببطء الحل فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة مع الحل أحادي القاعدة حتى يتم التوصل إلى الرقم الهيدروجيني من 8.5. إضافة توين-20-0،005٪.
    2. إعداد العينات غليكان. تمييع دوس glycans مترافق، (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-دوس)، 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-دوس) و6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-دوس (الشكل 1A )) وإلى أن تضعف إلى 100μg / مل في طباعة عازلة من step1.1.1. glycans الأحادية التكافؤ،diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2، 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) و6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) إلى 100μM في المخزن الطباعة من الخطوة 1.1.1. وأخيرا، وإعداد الأصباغ functionalized أمين، لاستخدام علامات شبكة / أضواء الهبوط. تطبع صبغ البقع علامة على 1 ميكرومتر.
      يستخدم Atto488-NHS الصبغة في طباعة لدينا: ملاحظة. ومع ذلك، أي صبغ functionalized أمين، للقراءة من قبل الماسح الضوئي الشريحة المناسبة لهذا الغرض.
    3. نقل 10 ميكرولتر من كل عينة غليكان لصفيحة معايرة دقيقة 384 بشكل جيد، وتستخدم لالروبوت الطباعة. glycans غير المستخدمة مخزن في حل العازلة الطباعة في -20 درجة مئوية في أنابيب مغلقة. TANSFER 10 ميكرولتر من علامة صبغ لوحة الطباعة.
  2. طبع
    ملاحظة: جميع الظريفملاحظة هذا القلق لمس أو تحريك الشرائح يجب أن يتم مع قفازات.
    1. وضع دبابيس arrayer في رأس الطباعة وفقا لتكوين الصحيح للتخطيط. لهذا تخطيط استخدام دبوس واحد لطباعة جميع العينات والمصفوفات. طباعة glycans في كتل من ست، وتخطي ميزة واحدة (يتم تعريف الميزة كما بقعة واحدة من مركب معين)، على كل جانب، بحيث بقع من نفس العينة لا يتم طباعة بالضبط بجانب بعضها البعض.
      ملاحظة: يجب على المستخدم النهائي يقرر التكوين.
    2. إزالة الشرائح من الحقائب، وصناديق مفتوحة، وإزالة أي جزيئات الغبار أو قطع صغيرة من البلاستيك التي قد تكون على سطوحها التي تهب الغاز النيتروجين نقاء فائقة عالية على كل شريحة. ضع العدد المرغوب فيه من الشرائح، والجانب المغلفة يصل، على المسرح arrayer.
    3. برنامج arrayer، واستخدام المعلمات من 27 نقاط في كل زيارة إلى لوحة مصدر، وذلك باستخدام 3 "قبل البقع" على الشرائح المغلفة بولي-L-يسين، لإزالة السائل الزائد على طرف دبابيس الطباعة
      1. تشغيل MPU (وحدة الطاقة الرئيسية) وحدة مراقبة المناخ. البرمجيات مفتوحة تحليل التبليط على جهاز الكمبيوتر.
      2. حدد تخطيط للطباعة. حدد خيارات → أداة دبوس لاستخدامها لطباعة مجموعة 1 × 1 أداة طباعة - 1 دبوس واحد. حدد علامة التبويب الهدف → أداة صفيف تعريف → طباعة نمط وإضافة الملعب (بقعة إلى بقعة المسافة)، وعدد من الصفوف والأعمدة لاستيعاب العينات التي سيتم طباعتها، ونمط الطباعة من العينات (لهذه المجموعة 8 يستخدم × 8 نمط الطباعة في 340 ميكرون الملعب لمدة 7 مجموع العينات).
      3. اختر تخطيط الشريحة المستهدفة → وبرنامج مسافة كتلة إلى كتلة للسماح للطباعة من كل مجموعة تكرار في قالب شريحة 48-جيدا (4 × 12). تحديد المصدر وإضافة عدد من الشاحنات الصغيرة المصدر (1 لكل عينة عند استخدام 1 دبوس) (لهذا الطباعة 7 بيك آب مصدر سيتم استخدامها لاستيعاب 6 آبار العينة و1 صبغ علامة جيدة).
        ملاحظة: الحوار مصدر يجب أن يتحول إلى اللون الأخضر لإظهار أن عددالزيارات مصدر مباريات العينات التي سيتم طباعتها في نمط الطباعة.
      4. تحديد الهدف → محول لوحة وحرك تخطيط وضبط رقم الشريحة (تطبع 5 الشرائح في وقت لهذه المطبوعة مع 1 شريحة اكتشاف مسبقا).
      5. الافراج عن الدرج وذلك بالضغط على زر T1 لتفعيل صينية وإضافة الرقم المطلوب من الشرائح إلى علبة، مع إيلاء اهتمام وثيق للمواقع الشريحة قبل اكتشاف (BLUE) والشرائح "الحقيقية".
      6. وضع الشرائح الزجاجية واضحة في كل المنافذ الفراغ المتبقي لمنع الفراغ وانقر فوق موافق لتفعيل فراغ. تأكد من أن كافة الشرائح تقام في مكان وانقر فوق موافق للعودة علبة إلى موضعها الأصلي.
      7. تحميل لوحة الطباعة في حامل لوحة وتأكد من تعيين الرف بشكل صحيح في المكان. انقر GO والسماح للعملية الطباعة للمتابعة.
    4. طباعة 24 النقاط المتبقية في مكررات من 6 نقاط لكل صفيف (4 المصفوفات / مصدر الزيارة).
    5. تحميل لوحات 384 جيدافي الطابعة والبدء في الطباعة. الحفاظ على الرطوبة النسبية، أثناء الطباعة، في جميع أنحاء طباعة ما بين 55 و 65٪. توقفت الطابعة عن بعد الطباعة 5 الشرائح.
      ملاحظة: في حين يتم طباعة ميكروأري في هذا الاختبار في نمط معين 8 × 8، ومختلف الروبوتات الطباعة ميكروأري تتطلب معدات برمجة محددة لتحقيق التخطيط المطلوب. والأمر متروك للمستخدم النهائي لتحديد النمط الأنسب نظرا مواصفات المعدات الخاصة بهم.
  3. الترطيب / الشل
    ملاحظة: بمجرد الشرائح الانتهاء من الطباعة، وأنها تخضع خطوة تجميد مؤقتة، كما دعا الرطوبة. الرطوبة في مرحلة ما بعد الطباعة يساعد على التجانس المرفق عينة عن طريق إعادة ترطيب البقع وضمان إتمام حظر.
    1. وضع الشرائح في غرفة الرطوبة 100٪ على الفور بعد الطباعة لمدة 30 دقيقة. بناء الغرفة عن طريق وضع مناشف ورقية مبللة جدا مسطحة في الجزء السفلي من وعاء زجاجي كبير، ووضع الشرائحعلى نوع من رف، مثل أنبوب اختبار رف، والطباعة حتى الجانب، وختم مع الاغطية البلاستيكية إلى فخ في الرطوبة.
    2. عدد الشرائح مع الكحول / المذيبات بمناسبة القلم مقاومة وتخزينها في مربع جفاف. يجفف بين عشية وضحاها.
  4. الترقيم، حجب، والتخزين
    1. إعداد عازلة تمنع - 50 ملم إيثانولامين في 50 ملي العازلة بورات. أولا، حل حمض البوريك، في [ده 2 O، إلى التركيز النهائي من 50 ملم في قارورة تحتوي على شريط مغناطيسي. تحريك الحل بقوة على طبق من اثارة حتى يذوب كل الصلبة. مع التحريك باستمرار، إضافة كمية مناسبة من إيثانولامين من حل 16.54 M الأسهم للوصول إلى 50 التركيز ملي المطلوب. إضافة هيدروكسيد الصوديوم المركز على التكيف مع درجة الحموضة النهائية من 9.2.
    2. تزج الشرائح المطبوعة في الحل عازلة تمنع لمدة 1 ساعة.
    3. بعد 1 ساعة، وشطف الشرائح في ده 2 O لإزالة أي آثار الزائدة من عرقلة العازلة.التخلص عازلة تمنع في حاوية النفايات المناسبة.
    4. نقل الشرائح إلى أصحاب تلطيخ زجاج وتدور الجافة. صفائف الجافة عن طريق وضعها في جهاز للطرد المركزي مجهزة أصحاب وحة يتأرجح، بسرعة 10 x ج لمدة 5 دقائق.
    5. مرة واحدة الشرائح جافة، فإنها يمكن أن تكون المحتضنة مباشرة أو تخزينها. ظروف التخزين و-20 درجة مئوية في كيس من البلاستيك مختوم.

2. تحليل البروتينات ملزم غليكان

  1. إعداد غرفة ترطيب فيه صفائف إلى أن تهجين تناسب. وتتكون غرفة بسيطة من طبق بيركس، الطبقات في القاع مع مناشف ورقية رطب والحامل، والتي على الشرائح ستقع.
  2. استخدام يكتينس المعقدة البيروكسيديز SNA (سامبوكا السوداء راصة) واللجنة الاقتصادية لأفريقيا (الحمرية راصة cristagalli) في 10 ميكروغرام / مل + 2 ميكروغرام / مل من Streptavidin-555 صباغة، في التحقيق عازلة (PBS + 0.01٪ توين 20). لHA (A / فيتنام / 1203-1204 H5N1 و A / KY / 07 H1N1، في هذا المثال)، واستخدامتركيز انطلاق من 20 ميكروغرام / مل قبل المعقد، كما هو موضح سابقا (34). لفترة وجيزة، وجعل HA: الفأر α-بكتيريا: الماعز-α-ماوس Alexa647 الخليط في عرقلة العازلة (PBS + 3٪ BSA + 0.01٪ توين-20)، في نسبة 4: الرحى 1: 2.
    ملاحظة: يتم بحثها المصفوفة مع يكتينس للتأكد من أن glycans وثبتوا وكشفها (الشكل 1B).
  3. نقل الحل البروتين الأجسام المضادة ملزم غليكان مزيج من 20 ميكرولتر إلى 384 لوحة جيدا واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. مخفف تسلسليا كتين وعينات HA 1: 1، في المخزن على النحو المناسب، 8 مرات، عن طريق خلط 10 ميكرولتر من العينة مع 10 ميكرولتر من العازلة.
  4. ماصة 8 ميكرولتر من العينة على سطح جيدا الصغيرة واحتضان في غرفة مغلقة الترطيب (100٪ RH) لمدة 90 دقيقة.
  5. تغسل الشرائح في وقت واحد من خلال عقد حواف وغمس منهم أربع مرات في خليط من برنامج تلفزيوني و 0.05٪ توين، ثم أربع مرات في برنامج تلفزيوني، وأخيرا أربع مرات في H 2 O. منزوع الأيونات عن طريقنفس البروتوكول التجفيف هو موضح في الخطوة حظر، تدور صفائف تجف في أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10 ز س.

3. المسح وبيانات تحليلات

ملاحظة: يمكن مسحها وميكروأرس غليكان في بيئات مختلفة، اعتمادا على تصنيع الماسح الضوئي ميكروأري ل. من خلال تغيير قوة الليزر والقرار، ويمكن للأداة إنتاج صورة مع العديد من الإشارات ممكن داخل النطاق الديناميكي في (الشكل 1C).

  1. استخدام الماسح الضوئي الشرائح الفلورسنت وتفحص صفائف مباشرة بعد الحضانة مع البروتينات ملزمة غليكان. الحرص على ضمان إدراج الشريحة بشكل صحيح إلى أداة المسح الضوئي.
    1. فتح برنامج المسح. انقر فوق ابدأ لفتح البرنامج. الاتصال الماسح الضوئي: الماسح الضوئي → اتصال أو رابط في قائمة لوحة الماسح الملاحة.
    2. الباب المفتوح الملقم الآلي من الماسح الضوئي. وضع الشرائح في فتحات في الملقم الآلي في ترتيب معين. أغلق باب الملقم الآلي. CLإك "قراءة محمل" في لوحة أدوات الملاحة لصناعة السيارات كشف الشرائح في الماسح الضوئي.
    3. تعيين معلمة المسح الضوئي: معلمات الماسح الضوئي → المناسبة لهذه التجربة (على سبيل المثال 635 قوة الليزر عالية، وزيادة الكشف عن 50٪). الشرائح مسح: الماسح الضوئي → المسح الضوئي. تحديد مسار عن طريق إنشاء مجلد لحفظ الصور المسح الضوئي واسم المسح الفردية. هل هذا قبل المسح الفعلي. كرر لكل شريحة على حدة. انقر فوق موافق لبدء المسح الضوئي.
  2. استخدام برنامج الماسح الضوئي لإعداد الصك ومسح الشرائح. تعيين الماسح الضوئي لمسح متكرر في قوة الليزر منخفض (5 ميغاواط) مع زيادة إعدادات كسب 25٪، 50٪ و 75٪.
    ملاحظة: يمكن اختبار الإعدادات والأمثل، ولكن نأخذ في الاعتبار أن كل فحص يمكن ربما تخفض الانتاج مضان من الأصباغ بسبب photobleaching من.
    1. الحصول على البيانات المفتوحة وبرامج التحليل مثل برنامج MAPIX. انقر فوق ابدأ لفتح البرنامج. فتح مسح صورة: ملف → ايم مفتوحةعمر. فتح ملف GAL: تحليل → شبكة مفتوحة واختيار ملف GAL المناسب.
    2. ادخل إلى وضع كتل: وضع صورة → الكتل لنقل الشبكة. استخدام علامات شبكة لضبط الشبكة إلى الموقع المناسب على الشريحة. ضبط القطع الفردية عند الضرورة لتتناسب مع مجموعة المطبوعة.
    3. أدخل وضع النقاط: صورة → وضع النقاط على ضبط الموقع وحجم البقع الفردية داخل الكتلة. مرة واحدة يتم ضبط جميع الكتل والبقع وفي المكان، شدة إشارة مقياس تحليل من قبل حسابات الضوئية →. حفظ الملف الناتج.
  3. مرة واحدة الشرائح قد انتهت المسح الضوئي، ويتم تحليل الصور لإشارات ملزم مع برنامج لمعالجة الصور المثبتة (1D الشكل - G). لتحليل الصور، تحميل ملف GAL (قائمة صفيف) على صورة TIFF الممسوحة ضوئيا.
    ملاحظة: يحتوي الملف GAL كل من نمط تخطيط بقعة وهويات كل مكان البقعة. ملفات غال للصفائف هي CRعتيد بواسطة برنامج الطابعة باستخدام ملف نصي المفصول الذي يحتوي على هويات العينات ومواقعها في لوحة مصدر 384 أيضا.
  4. استخدام شبكة أضواء علامة / هبوط المطبوعة على المجهرية لوضع صحيح الشبكة غال. قد تحتاج البقع الفردية يمكن نقلها بشكل فردي، ولكن مجموعة المطبوعة بشكل جيد يسمح عموما الكتل داخل الشبكة لتوضع مع سهولة. وبعد وضع الشبكة، وجمع شدة بقعة من قبل البرنامج وحفظها كملف نصي المفصول (النص).
    1. باستخدام برنامج جداول البيانات، فتح ملف الإخراج من الماسح الضوئي. فتح ملف الماكرو المناسب من موقع المجلد. انقر فوق عرض → ماكرو → RunMacro.
      ملاحظة: قبل الخطية ونسخ بيانات الناتج الخام، وإزالة الصفوف والأعمدة التي لا داعي لها، فرز البيانات عن طريق العينة، وحساب متوسط ​​القيم الأساسية إشارة ناقص متوسط ​​ورسم القيم الناتجة في إلى ورقة عمل ورقة انتشار تحتوي على الرسوم البيانية لكل من عصيدة ستةاختبار ليه على مجموعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الطباعة والمسح الضوئي والبيانات ويحلل

لضمان الطباعة الصحيحة، فمن الأهمية بمكان أن يكون المحاذاة الصحيحة من الشبكة رصدت داخل قناع تفلون، الذي يحدد كل مجموعة على الشريحة. أثناء الطباعة، ويرجع ذلك إلى طبيعة طلاء تفلون، والبقع لا يمكن رؤيتها بالعين المجردة على الشرائح MPX. ويولى اهتمام ثم إلى ظهور ما قبل البقع على الشرائح بولي-L-ليسين المغلفة. مباشرة بعد الطباعة، يجب فحص كل شريحة من العين لوجود كل مجمع رصدت التي مرئيا بسبب الأملاح في المخزن المؤقت المجففة في المكان. يتم فحص صفائف المحاذاة الصحيحة من البقع داخل حدود تفلون والعدد الصحيح من الميزات رصدت.

يتم فحص الشرائح في عملية تكرارية من أدنى إلى أعلى سلطة المسح الضوئي لتجنب تبييض الصور والسماح للمقارنة المهزومةالطمع لها لخفض الطمع ملزم البروتينات، والتي لها إشارات ارتفاع وانخفاض الانتاج، على التوالي. بعد المسح الضوئي، ويتم قياس كثافة الفلورسنت من كل بقعة في انتاج الصور باستخدام برنامج التصوير. وتراكب إعلان كل مجموعة مع ملف شبكة يطابق عدد من الميزات المطبوعة على السطح مجموعة (1D الشكل - G). باستخدام الأصباغ الفلورية المطبوعة، ويتم تحديد حدود glycans المطبوعة وقناع التي تتكامل مع هوية العينة المطبوعة lassoes كل بقعة. قناع التصوير اسو سوف يتم تسجيل كافة جوانب بقعة المصورة (حجم وكثافة الإشارة، وينسق في الشبكة، الخ) والمخرجات هذه المعلومات إلى ملف نصي المفصول. باستخدام برنامج جدولة (جدول)، يتم فرز العينات التي الهوية وبلغ متوسط ​​كثافة إشارة يعني ناقص خلفية أكثر من 4 من 6 نقاط لكل عينة، تاركة أعلى وأدنى إشارة كما القيم المتطرفة. رسم بياني خط متوسط ​​إشارة متوسطيتم رسم الخلفية ناقص ضد تركيزات البروتين ثمانية تطبيقها على مجموعة ويحتوي على سطر واحد لكل عينة. ومهد الرسم البياني الناتج النهائي باستخدام الانحدار حساب غير الخطية (الشكل 1I).

غليكان البروتينات ملزمة

يتم استخدام صفيف أجزاء من الكمية المخصصة لتقييم خصوصية ملزم المستقبلة من الأنفلونزا A hemagglutinins الفيروس. ميزة إضافية من مجموعة لدينا، لم يكن موجودا في لوحة فحص مماثل، هو إدراج ضوابط غير sialylated في نفس الدقيقة جيدا. لتقييم أن مركبات المطبوعة موجودة بعد الطباعة، يكتينس النباتية المستخدمة عادة مع استخدمت خصوصية معروفة. اللجنة الاقتصادية لأفريقيا تربط لسكر اللبن محطة مرتبطة β1-4 إلى N-أسيتيل الجلوكوزامين (Galβ1-4GlcNAc أو LacNAc) ولن ربط إذا توج اللبن مع محطة الحامض اللعابي. اللجنة الاقتصادية لأفريقيا يكشف فقط glycans غير sialylated على موقعنا آر غليكان المنمنمةعبد المنعم يوسف (الشكل 2A). عدم وجود الربط إلى أي من العينات غليكان sialylated يدل أيضا أن هذه هي توج تماما مع الحامض اللعابي المحطة. لα2-6 الحامض اللعابي مرتبط، كان يستخدم SNA كعنصر تحكم كتين (الشكل 2B). كما هو متوقع، SNA يربط فقط لα2-6 الأحماض اللعابي مرتبط، ولكن مع وجود اختلافات ملحوظة في تقارب لتكرار دى LacNAc مرتبطة غير دوس-المرتبط دوس. هذا الاختلاف يعكس حساسية glycans المرتبطة دوس ويسمح للتمييز من البروتينات التي قد ربط مع الطمع منخفضة. لα2-3 الحامض اللعابي مرتبط، على هيماغلوتينين H5 المستمدة من A / فيتنام / 1203-1204 الفيروس الذي يعرف على الاعتراف α2-3 ترتبط الأحماض اللعابي فقط تم استخدام 6. البيانات الشخصية الملزم للH5 HA يظهر في الواقع خصوصية لα2-3 الأحماض اللعابي مرتبط، مع الطمع العالي للهياكل ترتبط أجزاء من الكمية المخصصة (الشكل 2C). وأخيرا، تم استخدام هيماغلوتينين H1 من سلالة H1N1 الموسمية البشري الذي، كما هو متوقع، فقطبد أن α2-6 الهياكل حمض تحتوي على اللعابي المرتبطة (الشكل 2D).

شكل 1
يحلل الطباعة والمسح الضوئي وصورة يظهر (A)-دوس مترافق 6SLNLN كهيكل غليكان التمثيلي التي يتم طباعتها على الشرائح الزجاجية: الشكل 1. ويرد (ب) تفرخ بروتين ملزمة غليكان على مجموعة متعددة جيدا غليكان مع حجم 8 ميكرولتر أن يخلق قطرات على سطح مصفوفة. (C) وبعد الحضانة من البروتينات ملزمة غليكان على مجموعة والمسح الضوئي في متحد البؤر الماسح الضوئي الشرائح الفلورسنت، يتم الحصول على صورة تمثيلية. وتراكب إعلان (D) وصورة مع الشبكة، واستخدام علامات شبكة لالمحاذاة الصحيحة، يمكن تحليل البقع واحدة. (E) وقرب مجموعة كاملة من 8 المصفوفات، التي بروتين ملزمة غليكان واحدتم تحليلها باستخدام ثمانية 1: 1 التخفيفات. (F) وهناك مجموعة واحدة، في بئر واحدة وتمثيل. وdemarked مجموعة من علامات الشبكة في أعلى يمين (3 نقاط) والجزء السفلي الأيسر (2 نقاط)، هذا البروتين ملزم غليكان يربط مركب واحد على مجموعة باعتباره مكرر من ستة واضحة للعيان. يظهر (G) والشبكة مع lassos تطويق بؤر فردية معينة. (H) برنامج التصوير بحساب القيم إشارة من ملف الصورة وإخراج ملف بيانات المفصول. (I) يمكن جدولتها البيانات في جدول بيانات أو برامج stastical لإنشاء رسم بياني الانتاج التمثيلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الإخراج من يكتينس مصنع (اللجنة الاقتصادية لأفريقيا، SNA) وIAV هيماgglutinins مع خصوصيات مختلفة (H5 من A / فيتنام / 1203-1204، H1 من A / كنتاكي / 07). (A) اللجنة الاقتصادية لأفريقيا تربط LacNAc محطة أو Galb1-4GlcNAc على وجه التحديد، وبالكشف عن وجود مركبات غير sialylated، كما تستخدم الضوابط لhemagglutinins IAV. يعترف (ب) SNA فقط glycans تحمل الحامض اللعابي α2-6 المحطة. (ج) هيماغلوتينين المؤتلف من H5N1 (A / فيتنام / 1203-1204) سلالة بربط α2-3 الأحماض اللعابي ويقدم ملفا الطيور نوع مستقبلات ملزمة. (D) وراصة دموية المؤتلف من H1N1 الموسمية الإنسان (A / كنتاكي / 07) يربط إلى نوع البشري مستقبلات فقط. وقد تم قياس كثافة إشارة الفلورسنت لكل بقعة، وتعني شدة ناقص يعني حسبت الخلفية باستخدام برنامج جداول البيانات. لكل غليكان، يتم حساب كثافة إشارة متوسط ​​من 6 يعيد البقع. أعلى وأدنى إشارات من 6 مكررات قد ألغيت و4 نسخة المتبقيةيتم استخدام قسم التدريب والامتحانات لحساب متوسط ​​إشارة والانحراف المعياري (SD)، وقياس الخطأ المعياري (SEM). الرسوم البيانية تمثل متوسط ​​خلفية إشارة ناقص متوسط ​​لكل عينة والخطأ الحانات هي قيمة SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقييم IAV مستقبلات خصوصية خطوة هامة في تحليل القدرة على إحداث جائحة من فيروسات أنفلونزا الطيور. يرتبط الاعتراف الحامض اللعابي من قبل الفيروس إلى العديد من الخصائص البيولوجية مثل ملزمة لوإطلاق سراح من الخلية. المعرفة التي هي ضرورية الطفرات الأحماض الأمينية لفيروسات انفلونزا الطيور لتحقيق α2-6 ملزمة وعبور الحواجز القائمة بين الأنواع يمكن التأهب لمواجهة الجائحة. وتستخدم عدة فحوصات لتحديد مستقبلات خصوصية. ومع ذلك، وكلها لها سلبياتها، بما في ذلك فقط قياس الطمع وعدم التحديد، والعكس بالعكس.

نحن هنا وصف أداة رواية المنمنمة على أساس تستخدم على نطاق واسع وقبلت ELISA، والذي يستخدم شظايا محطة المرتبطة أجزاء من الكمية المخصصة من glycans أكثر تعقيدا. باستخدام 4 يكتينس واضحة المعالم، 2 محطة و 2 من الأنفلونزا A أصل الفيروس، وتبين لنا أن نحافظ على خصوصية والطمع النسبي.

عندما نحسب كمية من الحد من المواد الكيميائية وbiologكال المستخدمة من قبل التصغير إليسا على رقاقة مجموعة غليكان، نصل إلى اختلافات كبيرة لافت للنظر. أولا، البيولوجية. نستخدم 10X أقل حجم فحص واستخدام 6 مركبات اختبار في 6 مكررات. وهذا يمكن أن تحسب أن ما يعادل 36X الصفوف في لوحات 96-جيدا. والنتيجة هي أن نستخدم 360x أقل البيولوجية. وتشمل الخطوات الحاسمة الطباعة المناسبة وخطر خلفيات عالية باستخدام وكلاء ملزم غليكان غير المكرر أو ضعف الأجسام المضادة كشف.

المركبات المستخدمة في هذا الاختبار، وإن كانت لا تزال متاحة، ليست مصنوعة بسهولة عن طريق التخليق الكيماوي الأنزيمية. باستخدام تكنولوجيا متطورة، والطباعة، كل بقعة هي فقط 2 نيكولا لانغ، مقارنة مع 100 ميكرولتر لكل بئر من وحة microtiter. طباعة شريحة واحدة تحتوي على 48 بئرا و 6 مركبات، في 6 مكررات، ونحن تستهلك ما يقرب من 1152 NL. الإجراء طلاء نفسه في 96-جيدا لوحات النتائج في طلاء ما مجموعه 1،842 بئرا مع 100 ميكرولتر من مركب في نفس التركيز. لذلك، والطباعة رانه يضاعف بالمقارنة مع فحص لوحة، ونحقق انخفاض ضرب من 1،500x. لذلك، في المجموع، وتخفض البيولوجية 360 أضعاف، واستهلاك غليكان من 1500 أضعاف. باستخدام معالجات السائل الروبوتية، ونحن نتصور أن معظم الخطوات التي يمكن أن يكون آليا، مما يتيح استخدامها في فحص كامل كشاشة الإنتاجية العالية.

على الرغم من أن ميكروأرس الطباعة والتحليلات صورة لاحقة لا تتطلب آليات وأدوات خاصة، وهذه الأدوات ليست نادرة وموجودة في العديد من الجامعات والمعاهد. الطباعة المباشرة ولا تتطلب تغييرات كيميائية. ولذلك، فإننا نعتقد أنه، مع هذا الحد الأدنى من المركبات وتقنية الطباعة بسيطة، هذا الاختبار يمكن أن يكون أكثر قابلية للتطبيق بشكل عام. كما أنه يقلل من حجم الحضانة، وتكاليف الأجسام المضادة والبيولوجية الثمينة، وهذه التقنية تجعل من الممكن للمختبرات مع الموارد المحدودة لتقييم خصوصية IAV أو غيرها من البروتينات ملزمة غليكان مع الدقة العالية مع المحافظة على أقل تكلفةالصورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل في جزء من مرفق سكريبس ميكروأري الأساسية، وعقد من مراكز السيطرة على الأمراض (JCP). RPdV هي المستفيدة من منحة خطوة جريئة وشفني من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO). قدم الكونسورتيوم لGlycomics الوظيفية (http://www.functionalglycomics.org/) بتمويل من منحة NIGMS GM62116 (JCP) عدة glycans المستخدمة في هذه الدراسة. هذا هو نشر 29113 من معهد سكريبس للأبحاث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEXTERION® Slide H MPX-48  Schott 1091525 Microwell slides
ProScanArray Plus  PerkinElmer discontinued confocal microarray scanner
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software Innopsys - confocal microarray scanner
MicroGrid II  Digilab - microaray printer
SNA Vector Labs B-1305  Plant Lectin
ECA Vector Labs B-1145  Plant Lectin
Anti-Strep Antibody IBA 2-1509-001  Anitbody for HA binding
Anti-Mouse Alexa-647 Life A-21235 Anitbody for HA binding
Tween-20 Sigma P2287  detergent
di-basic Sodium Phosphate Sigma 255793 printing buffer component
mono-basic Sodium phosphate Sigma 229903  printing buffer component
poly-l-lysine solution Sigma P8920  pre-spotting slide component
sodium hydroxide Sigma 221465 pre-spotting slide component
ethanol Sigma 493546 pre-spotting slide component
phosphate buffered saline Corning 46-013-CM incubation/washing buffer
SMP4B pins Telechem SMP4B printing pin
Compressed Nitrogen (Grade5) Praxair UN1066 general dusting/drying tool
Boric Acid Sigma B6768-500G Slide blocking reagent
ethanolamine Sigma E9508-500ML Slide blocking reagent
Atto 488 AttoTec AD 488-91 Gridmarker on array
PAA-LNLN Consortium for Functional Glycomics PA368 Spotted glycans
PAA-3SLNLN Consortium for Functional Glycomics PA362 Spotted glycans
PAA-6SLNLN Consortium for Functional Glycomics PA343 Spotted glycans
LNLN Consortium for Functional Glycomics Te98 Spotted glycans
3SLNLN Consortium for Functional Glycomics Te175 Spotted glycans
6SLNLN Consortium for Functional Glycomics Te176 Spotted glycans
384-well microtiter plate Matrix TechCorp 4361 Printing plate
VWR lab marker VWR 52877-150 Slide Numbering
Wheaton slide staining dish Sigma Z103969-1EA Blocking and Drying

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
  2. Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
  3. Bouvier, N. M., Palese, P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 26, Suppl 4. D49-D53 (2008).
  4. Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
  5. Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
  6. Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
  7. Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
  8. Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
  9. Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
  10. Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
  11. Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
  12. Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
  13. Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
  14. Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
  15. Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
  16. Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
  17. Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
  18. Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
  19. Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
  20. Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
  21. Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
  22. Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
  23. Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
  24. Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
  25. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  26. Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
  27. Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
  28. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  29. Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
  30. Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
  31. Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
  32. de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
  33. Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
  34. de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).

Tags

علم المناعة، العدد 111، غليكان مصفوفة، الحامض اللعابي، بولي أكريلاميد (دوس) والأنفلونزا، راصة دموية، كتين، اللبن، LacNAc
والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McBride, R., Paulson, J. C., de… More

McBride, R., Paulson, J. C., de Vries, R. P. A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins. J. Vis. Exp. (111), e53847, doi:10.3791/53847 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter