باستخدام استراتيجية المصفوفة الدقيقة المطبوعة للجليكان ، تم تصغير مقايسة الألواح التقليدية المكونة من 96 بئرا لتحليل شفق هيماجلوتينين فيروس الأنفلونزا A وخصوصيتها للمستقبلات المحتوية على حمض السياليك.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فيروس الانفلونزا (IAV) hemagglutinins الاعتراف الأحماض اللعابي على سطح الخلية كما مستقبلات وظيفية للحصول على دخول الخلايا. الطيور المائية البرية هي المستودع الطبيعي لIAV، ولكن IAV يمكن عبور الحواجز القائمة بين الأنواع والدواجن والخنازير والخيول والبشر. فيروسات أنفلونزا الطيور تعترف الحامض اللعابي تعلق على اللبن قبل الأخير من الربط α2-3 (من نوع الطيور مستقبلات) في حين أن الفيروسات التي تصيب البشر تعترف تفضيلي الحامض اللعابي مع الربط α2-6 (النوع البشري مستقبلات). لمراقبة إذا فيروسات أنفلونزا الطيور والتكيف مع مستقبلات نوع الإنسان، عدة طرق يمكن استخدامها. تستخدم المجهرية غليكان مع مكتبات متنوعة من sialosides الاصطناعية على نحو متزايد لتقييم مستقبلات خصوصية. ومع ذلك، لا يتم استخدام هذه التقنية لقياس avidities. ويتحقق القياس من الطمع عادة من خلال تقييم ملزم من هيماغلوتينين تخفيفه بشكل متسلسل أو الفيروس إلى glycans كثف لمادة البولي بروبيلين لوحات 96-جيدا التقليدية. في هذا الاختبار، glycans مع αتقترن 2-3 أو α2-6 الأحماض اللعابي إلى البيوتين وكثف لوحات streptavidin، أو تقترن لبولي أكريلاميد (دوس) الذي كثف مباشرة على البلاستيك. لقد المنمنمة إلى حد كبير هذا الاختبار عن طريق طباعة مباشرة sialosides المرتبطة دوس ونظرائهم غير مرتبطة دوس على الشرائح الزجاجية جيدا الصغيرة. هذه مجموعة المتابعة، مع 48 المصفوفات على شريحة واحدة، تمكن فحوصات في وقت واحد من 6 غليكان ملزمة البروتينات في 8 التخفيفات، استجواب 6 glycans مختلفة، بما في ذلك عنصري تحكم غير sialylated. هذا هو ما يعادل 18X لوحات 96-جيدا في فحص لوحة التقليدي. شكل مجموعة غليكان يقلل استهلاك مركبات والبيولوجية، وبالتالي إلى حد كبير يعزز كفاءة.
المقدمة
الطيور المائية البرية هي المستودع الطبيعي لIAV، ولكن IAV قادرة على عبور الحواجز القائمة بين الأنواع والدواجن والثدييات، بما في ذلك البشر. IAVs الطيور الاعتراف α2-3 الأحماض اللعابي المرتبطة (من نوع الطيور مستقبلات)، في حين أن الفيروسات التي تصيب البشر ربط α2-6 الأحماض اللعابي المرتبطة (من نوع البشري مستقبلات). لتكون قادرة على تكرار بكفاءة ونقل بين البشر والطيور IAV يحتاج إلى ربط الإنسان من نوع مستقبلات 1.
وتنقسم IAVs بناء على الأمصال التي تميز استضداد من هيماغلوتينين من (HA) والنورامينيداز (NA) بروتينات سكرية المغلف. HA يربط الأحماض اللعابي، في حين N....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك.
1. صفيف البناء
- إعداد غليكان وإعداد لوحة
- إعداد المخزون من المخزن الطباعة. تأكد أولا من 500 مل من حل 150 ملي الأسهم من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة. أيضا جعل 50 مل من حل 150 ملي الأسهم من أحادي القاعدة حل فوسفات الصوديوم. في قارورة، وذلك باستخدام بقضيب ودرجة الحموضة متر المغناطيسي، يعاير ببطء الحل فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة مع الح....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الطباعة والمسح الضوئي والبيانات ويحلل
لضمان الطباعة الصحيحة، فمن الأهمية بمكان أن يكون المحاذاة الصحيحة من الشبكة رصدت داخل قناع تفلون، الذي يحدد كل مجموعة على الشريحة. أثناء الطباعة، ويرجع ذلك إلى طبيعة طلاء تفلون، والبقع لا يمكن رؤيتها بالعين المجردة على الشرائح MPX. ويولى اهتمام ثم إلى ظهور ما قبل البقع على الشرائح بولي-L-ليسين المغلفة. مباشرة ب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقييم IAV مستقبلات خصوصية خطوة هامة في تحليل القدرة على إحداث جائحة من فيروسات أنفلونزا الطيور. يرتبط الاعتراف الحامض اللعابي من قبل الفيروس إلى العديد من الخصائص البيولوجية مثل ملزمة لوإطلاق سراح من الخلية. المعرفة التي هي ضرورية الطفرات الأحماض الأمينية لفيروسات انفلونزا الطيور لتحقيق α2-6 ملزمة وعبور الحواجز القائمة بين الأنواع يمكن التأهب لمواجهة الجائحة. وتستخدم عدة فحوصات لتحديد مستقبلات خصوصية. ومع ذلك، وكلها لها سلبياتها، بما في ذلك فقط قياس الطمع وعدم التحديد، والعكس .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل في جزء من مرفق سكريبس ميكروأري الأساسية، وعقد من مراكز السيطرة على الأمراض (JCP). RPdV هي المستفيدة من منحة خطوة جريئة وشفني من المنظمة الهولندية للبحوث العلمية (NWO). قدم الكونسورتيوم لGlycomics الوظيفية (http://www.functionalglycomics.org/) بتمويل من منحة NIGMS GM62116 (JCP) عدة glycans المستخدمة في هذه الدراسة. هذا هو نشر 29113 من معهد سكريبس للأبحاث.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| NEXTERION® الشريحة H MPX-48 ؛ | Schott | 1091525 | Microwell ينزلق |
| ProScanArray Plus | توقف PerkinElmer | عن الماسح الضوئي المصفوفات الدقيقة متحد البؤر | |
| Innoscan 1100AL Scanner / Mapix Software | Innopsys-confocal | microarray | |
| MicroGrid II & nbsp ؛ | طابعة | Digilab-microaray | |
| SNA | Vector Labs | B-1305 ؛ | نبات الليكتين |
| مختبرات ناقلات | اللجنة الاقتصادية لأفريقيا | B-1145 | نبات الليكتين |
| الأجسام المضادة المضادة للبكتيريا العقدية | IBA | 2-1509-001 | Anitbody لربط HA |
| المضادة للفأر Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody ل HA ملزمة |
| Tween-20 | Sigma | P2287 ؛ | منظف |
| ثنائي القاعدة فوسفات الصوديوم | سيجما | 255793 | مكون عازلة الطباعة |
| أحادي القاعدة فوسفات الصوديوم | سيجما | 229903 | مكون المخزن المؤقت للطباعة |
| محلول بولي ليسين | Sigma | P8920 ؛ | مكون شريحة ما قبل اكتشاف |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيجما | 221465 | مكون الشريحة المسبق |
| للاكتشاف الإيثانول | سيجما | 493546 | الشريحة المسبق للفوسفات |
| المخزن الملحي | Corning | 46-013-CM | حضانة / غسيل عازلة |
| SMP4B دبوس | الطباعة Telechem | SMP4B | دبوس |
| الطباعة النيتروجين المضغوط (الصف 5) | Praxair | UN1066 | أداة الغبار / التجفيف العامة |
| حمض البوريك | Sigma | B6768-500G | كاشف حجب الشرائح |
| إيثانول أمين | سيجما | E9508-500ML | كاشف حجب الشرائح |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker على صفيف |
| PAA-LNLN | Consortium ل Glycomics الوظيفية | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium ل Glycomics الوظيفية | PA362 | Spotted glycans |
| Consortium PAA-6SLNLN | ل Glycomics الوظيفية | PA343 | Spotted |
| glycans LNLN Consortium for Glycomics الوظيفية | Te98 | Spotted glycans | |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Glycomics الوظيفية | Te176 | الجليكان المرقط |
| 384 بئر لوحة ميكروتيتر | مصفوفة TechCorp | 4361 | لوحة الطباعة |
| VWR مختبر علامة | VWR | 52877-150 | ترقيم الشرائح |
| طبق تلطيخ الشريحة | Sigma | Z103969-1EA | الحجب والتجفيف |
المراجع
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional ba....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
