Met behulp van een gedrukte glycaan-microarray-strategie werd een conventionele 96-wells plaat assay geminiaturiseerd voor analyse van hemagglutinine aviditeit en specificiteit voor sialic acid bevattende receptoren van het influenza A-virus.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geminiaturiseerde Glycan Microarray Assay voor het beoordelen van Avidity en specificiteit van influenza A-virus hemagglutinine
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Influenza A virus (IAV) hemagglutinine herkennen siaalzuren op het celoppervlak als functionele receptoren invoer in cellen te krijgen. Wilde watervogels zijn de natuurlijke reservoir voor IAV, maar IAV kan de soort barrière voor pluimvee, varkens, paarden en mensen te steken. Aviaire virussen herkennen siaalzuur door een α2-3 koppeling (aviaire-type receptoren) om een voorlaatste galactose bevestigd terwijl menselijke virussen bij voorkeur siaalzuur met een α2-6 koppeling (human-type-receptoren) te herkennen. Om te controleren of aviaire virussen zich aanpassen aan de menselijke soort receptoren, kan op verschillende manieren worden gebruikt. Glycan microarrays met diverse bibliotheken van synthetische sialosides worden steeds meer gebruikt om receptorspecificiteit te evalueren. Echter is deze techniek niet gebruikt voor het meten aviditeiten. Meting van de aviditeit wordt gewoonlijk bereikt door het evalueren van de binding van serieel verdunde virus hemagglutinine of glycanen geadsorbeerd conventionele polypropyleen 96-well platen. In deze assay glycanen met α2-3 of α2-6 siaalzuren gekoppeld aan biotine en streptavidine geadsorbeerd aan platen of gekoppeld zijn met polyacrylamide (PAA) die direct adsorberen aan de kunststof. We hebben aanzienlijk verkleind deze test door direct printen-PAA verbonden sialosides en hun niet-PAA gebonden tegenhangers micro-putjes objectglaasjes. Deze set-up, met 48 arrays op een enkele dia, maakt gelijktijdige analyses van 6 glycan bindende eiwitten op 8 verdunningen, ondervragen 6 verschillende glycanen, waaronder twee niet-gesialyleerde controles. Dit is gelijk aan 18x 96-well platen in de traditionele assay plaat. De glycan array-formaat vermindert consumptie van verbindingen en biologische en dus verbetert de efficiëntie.
Inleiding
Wilde vogels zijn de natuurlijke reservoir voor iav, maar IAV kan de soort barrière voor gevogelte en zoogdieren, waaronder de mens. Avian IAVS herkennen α2-3 gekoppelde siaalzuren (aviaire-type receptoren), terwijl menselijke virussen binden α2-6 gekoppelde siaalzuren (human-type-receptoren). In staat zijn om efficiënt te repliceren en te verzenden tussen mensen een aviaire IAV moet binden aan menselijke-type receptoren 1.
IAVS verdeeld gebaseerd op serologische dat de antigeniciteit van het hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) envelopglycoproteïnen karakteriseert. HA bindt aan siaalzuren, terwijl de NA-receptorvernietige....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven.
1. Array Construction
- Glycan Voorbereiding en Plate Setup
- Bereid een voorraad van de boekdrukkunst buffer. Maak eerst 500 ml van een 150 mM voorraadoplossing van dibasisch natriumfosfaat. Zorg er ook 50 ml van een 150 mM voorraadoplossing monobasisch natriumfosfaat oplossing. In een kolf met een magnetische roerstaaf en pH meter langzaam Titreer dibasisch natriumfosfaat oplossing met de monobasische oplossing tot een pH van 8,5 wordt bereikt. Add Tween-20-0,005%.
- Bereid de glycan monsters. Verdunde PAA geconjugeerde glycanen, (diLacNAc (Galβ1....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Printing, Scanning & Data analyse
Om een goede afdrukken te waarborgen, is het essentieel om de juiste uitlijning van de gevlekte net binnen de teflon masker, dat elke array op de dia bakent hebben. Tijdens het afdrukken, vanwege de aard van de teflonlaag kan vlekken niet met het blote oog de MPX dia. Aandacht wordt besteed dan aan het uiterlijk van de pre-vlekken op de poly-L-lysine gecoate glaasjes. Direct na het afdru.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het beoordelen van IAV receptor specificiteit is een belangrijke stap in het analyseren van mogelijke pandemie van aviaire virussen. Siaalzuur erkenning door het virus is gekoppeld aan verschillende biologische eigenschappen zoals binding aan en afgifte uit de cel. Kennis van die aminozuur mutaties nodig zijn voor aviaire virussen te bereiken α2-6 binding en steek de soort barrière maakt pandemie. Verschillende assays worden toegepast om receptor specificiteit te bepalen; echter allemaal hun nadelen, met alleen meten av.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Scripps Microarray Core Facility, en een contract van de Centers for Disease Control (JCP). RPdV is een ontvanger van een Rubicon en VENI-subsidie van de Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO). Het Consortium voor Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) gefinancierd door NIGMS subsidie GM62116 (JCP) die verschillende glycanen gebruikt in deze studie. Dit is publicatie 29113 van het Scripps Research Institute.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
| ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
| Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | - | confocal microarray scanner |
| MicroGrid II | Digilab | - | microaray printer |
| SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
| ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
| Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody voor HA binding |
| Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody voor HA binding |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
| di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | drukbuffercomponent |
| mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | drukbuffercomponent |
| poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
| sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
| ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
| phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubatie/wasbuffer |
| SMP4B pins | Telechem | SMP4B | drukpen |
| Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | algemeen stofvrij gereedschap |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blokkeringsreagens |
| ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blokkeringsreagens |
| Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker op array |
| PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
| PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
| PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
| LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
| 3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
| 6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
| 384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Drukplaat |
| VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide nummering |
| Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blokkering en drogen |
Referenties
- Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
- Xu, R., et al. Functional ba....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
