Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A

Published: May 29, 2016 doi: 10.3791/53847
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Cell and Molecular Biology, Chemical Physiology and Microbial Science, The Scripps Research Institute, 2Department of Medicinal Chemistry and Chemical Biology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University

Abstract

שפעת וירוס (IAV) hemagglutinins להכיר חומצות sialic על פני התא קולטנים תפקודית כדי לזכות הכניסה לתאי. עופות מים ברים הם המאגר הטבעי של IAV, אבל IAV יכול לחצות את מחסום המינים כדי עופות, חזירים, סוסים ובני אדם. וירוסים העופות להכיר חומצה sialic מחוברת גלקטוז הלפני אחרון על ידי הצמדה α2-3 (קולטנים מסוג העופות) ואילו וירוסים האדם מעדיפים להכיר חומצה sialic עם הצמדה α2-6 (קולטנים מטיפוס אנושי). כדי לפקח אם וירוסים העופות מסתגלים קולטנים מסוג אדם, מספר שיטות שניתן להשתמש בהם. microarrays glycan עם ספריות מגוונות של sialosides הסינתטי משמש יותר ויותר להעריך סגוליות הקולטן. עם זאת, הטכניקה הזו לא נעשה שימוש למדידת avidities. מדידת הלהיטות בדרך כלל מושגת על ידי הערכת עקידת hemagglutinin בדילול סדרתי או וירוס גליקנים שנספחו 96-גם צלחות פוליפרופילן קונבנציונליות. ב assay זה, גליקנים עם α2-3 או α2-6 חומצות sialic הם מצמידים את ביוטין שנספחו צלחות streptavidin, או הם מצמידים את polyacrylamide (PAA) אשר לספוג ישירות פלסטיק. יש לנו מיניאטורי משמעותי assay זה על ידי הדפסה ישירות sialosides PAA צמודי עמיתיהם PAA הלא צמוד שלהם בשקופיות זכוכית מיקרו היטב. הגדרה זו, עם 48 מערכים בשקופית אחת, מאפשרת מבחני סימולטני של 6 glycan מחייב חלבונים ב -8 דילולים, חוקר 6 גליקנים שונים, כולל שני פקדים שאינם sialylated. זה שווה 18x 96-גם צלחות ב assay הצלחת המסורתית. פורמט המערך glycan פוחת צריכת תרכובות וביולוגיה ובכך משפר את יעילות.

Introduction

עופות מים ברים הם המאגר הטבעי של IAV, אבל IAV הוא מסוגל לחצות את מחסום המינים כדי עופות ויונקים, כולל בני אדם. IAVS עופות להכיר חומצות sialic α2-3 צמוד (קולטנים מסוג העופות), ואילו וירוסי אדם להיקשר α2-6 חומצות sialic צמודות (קולטנים מסוג האדם). כדי להיות מסוגל לשכפל ביעילות ולהעביר בין בני האדם IAV עופות צריך להיקשר לקולטנים מסוג האדם 1.

IAVS מחולקים לפי סרולוגיה המאפיינת את antigenicity של hemagglutinin שלהם (HA) נורמינידאז גליקופרוטאינים המעטפה (NA). HA נקשר חומצות sialic, ואילו NA הוא האנזים להרוס קולטן בקצה השני של מחזור החיים של נגיפי ודבק sialic חומצה 2. כל הווירוסים מדביקים האדם, כולל H1N1, H2N2 ו H3N2, יש מוצא עופות 3. בשנים של העשורים האחרונים עופות כדי crossovers אדם התרחש, עם H5N1, H7N7, H7N9 ו להיות הכי ידוע; HoweVer, תת אחרים נגועים בני האדם יותר באופן ספוראדי (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. למרבה המזל, נראה כי אף אחד הווירוסים הללו הצליחו להסתגל באופן מלא לקולטנים חומצת sialic אדם מהסוג צמוד α2-6 5-8. הסתגלות של וירוסים zoonotic העופות או אחרים כדי להתאים שכפול והעברת ב המארחים אדם יכול להיות בעל השפעה הרסנית על בריאות האדם. לכן, ידע מוקדם של כמה וירוסים אלה מתפתחים להיקשר לקולטנים אדם מהסוג יעזרו מעקב חובק-עולם של נגיפי שפעת מתעוררים.

קביעת העדפת קולטן הובררה ראשונה באמצעות אריתרוציטים של מינים שונים ונשארת assay מועדף בקרב כל חוקרי שפעת 9-12. ההפגנה כי וירוסים העופות להכיר חומצה sialic α2-3 ווירוסים האדם α2-6 מקושר חומצה sialic התבססה במקור על assay באמצעות hemagglutination של אריתרוציטים מהונדסים enzymatically להכיל כל אחד linkages 13,14. למרות ההודעה היא hemagglutination, assay תקן וירולוגים, מבני glycan הבסיסיים אינם מוגדרים, הצמדת המסוף בלבד. בנוסף, הזמינות המוגבלת של sialyltransferases, המשמש מחדש sialylate התאים, מצמצמת את השימוש של assay זה 15-18. בהמשך לכך, שיטות אחרות של בקביעת העדפות מחייב קולטן הוכנסו באמצעות מבנים glycan sialylated צמוד פולי-acrylamide (PAA) או פולי-גלוטמט (PGA) מבנים מבוססי מבחני צלחת 19,20. כמה וריאציות אפשריות ציפוי גם את גליקנים או וירוסי צלחות microtiter, שכל אחת מהן התוצאה היא assay ELISA מהסוג איתנה, אמינות מאוד רגישה 21-23. לחלופין, גליקנים צמודים ביוטין יכולים להחליף PAA / PGA וניתן מצומדות כדי צלחות streptavidin מצופה 2,24. למרות שהחלק סר ספציפי עשויים להידרש, ELISAs הם גליקנים תקן וכמה צמוד PAA הם בקלות commercially ושאינם זמינים מסחרית (קונסורציום glycomics פונקציונלית (http://www.functionalglycomics.org)).

טכנולוגיות microarray glycan צמחו כמו כלי רב ערך כדי לקבוע סגוליות הקולטן, כפי הם הבחינו גליקנים שונים מרובים, והיקשרות מגוון רחב של מבנים שונים ניתן להעריך בתוך assay יחיד 25-29. עקידת IAV במבנים אלו מספקת הבנה טובה יותר של מבנים glycan כי IAV מזהה מועדף 30-33. microarrays glycan דורש כמויות קטנות של נפח דגימה לבצע assay מחייב ורק משתמש בכמויות זעירות של glycan לכל נקודה (2 nl). עם זאת, מערכים אלו משמשים בדרך כלל רק להעריך סגוליים של קולטנים גליקנים. ניתוח של וירוסים מרובים, או חלבוני hemagglutinin, בטווחי ריכוז מרובים יכול להיות מונע בשל מספר השקופיות הנדרשות. יתר על כן, עד כה, לא assay להיטות ביחס פותח באמצעות ar glycanטכניקות ray.

כדי לשלב את דרישת המדגם הנמוכה המוענקת על ידי טכניקות microarray glycan ואת הרגישות של גליקנים צמודים PAA מבחנים מבוססים ELISA, בקשנו לפתח מערך glycan רב גם שיאפשר ניתוח תפוקה גבוהה עם רזולוציה דומה או טובה יותר לעומת אל assay ELISA המבוסס המסורתי. במקביל, רצינו לצמצם את כמות ביולוגיות וכימיקלי כתב נצרכו. התוצאה הסופית היא assay להיטות מיניאטורי, שפותחה במיוחד עבור ניטור סגולי IAV והוא ישים באותה מידה להעריך חלבונים מחייבים glycan אחרים. באמצעות שקופיות זכוכית מתחלקות 48-בארות מייקרו ידי מסכת טפלון, 6 גליקנים שונים הם הבחינו ב 6 משכפל לכל טוב. פלטפורמת microarray מקנה המגמות אותו קולטן כריכה לראות בפורמט מאקרו ELISA עם מספר יתרונות. אלה כוללים (I) הדפסה של המתחם ב 6 משכפל, באמצעות מדגם מינימלי, לעומת ציפוי של כמה שורות אניצלחת נה, באמצעות 100 μl לכל היטב; (II) תרכובות שונות מרובות נתחו במקביל באר יחיד, לרבות בקרות; (III) ירידה מסיבית נפח דגירה; (IV) טווח דינמי גדול יותר באמצעות הודעת ניאון. שקופית יחידה ניתן לחשב להיות שווה ערך ל 18x 96-גם הצלחות.

עם הפרוטוקול הבא, מסוגל במעבדה כל בפברוק וניתוח הבחין microarrays אמור להיות מסוגל לייצר פורמט ELISA מיניאטורי זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת.

בניית Array 1.

  1. הכנת glycan והגדרת פלייט
    1. הכינו מלאי של חיץ הדפסה. תחילה הפוך 500 מ"ל של פתרון המניות 150 מ"מ של פוספט נתרן dibasic. גם לעשות 50 מ"ל של פתרון המניות 150 מ"מ של פתרון פוספט נתרן monobasic. בבקבוק, באמצעות בר ומערבבים מגנטי מטר pH, לאט לכיל הפתרון פוספט נתרן dibasic עם הפתרון monobasic עד pH של 8.5 הוא הגיע. הוספת Tween-20 0.005%.
    2. הכן את דגימות glycan. לדלל PAA גליקנים מצומדות, (diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA), 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA) ו 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ-PAA (איור 1A הם להיות מדולל)) כדי 100μg / ml דפוס חיץ מן step1.1.1. גליקנים חד ערכי,diLacNAc (Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ- (CH 2) 3 NH 2, 3SLNLN (Neu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2) ו 6SLNLN (Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1- 4GlcNAcβ - (CH 2) 3 NH 2)) כדי 100μM במאגר הדפסה משלב 1.1.1. לבסוף, להכין את הצבעים פונקציונליים האמינים, להשתמש כסמני רשת / אורות נחיתה. כתמים סמן דיי מודפסים ב 1 מיקרומטר.
      הערה: צבע Atto488-NHS משמש הדפסים שלנו. עם זאת, כל צבען פונקציונלי אמין, קריא על ידי סורק השקופיות מתאים למטרה זו.
    3. העברת 10 μl של כל דגימה glycan צלחות microtiter 384 גם משמש לטיפול רובוט הדפסה. חנות גליקנים בשימוש בתמיסת חיץ הדפסה ב -20 מעלות צלזיוס צינורות אטומים. Tansfer 10 μl של סמן צבע לצלחת הדפסה.
  2. הַדפָּסָה
    הערה: כל STEps כי חששו לגעת או להזיז את המגלשות חייבים להיעשות עם כפפות.
    1. מניח סיכות arrayer בראש ההדפסה על פי התצורה הנכונה של הפריסה. עבור פריסה זו להשתמש סיכה אחת כדי להדפיס את כל הדגימות ומערכים. הדפס את גליקנים בבלוקים של שש, מדלגי תכונה אחת (תכונה מוגדרת נקודה אחת של תרכובת מסוימת), בכל צד, כך כתם של המדגם הזהה אינם מודפסים בדיוק זה לצד זה.
      הערה: משתמש הקצה חייב להחליט את התצורה.
    2. סר שקופית משקיות, קופסות פתוחות, ולהסיר כל חלקיקי אבק או חתיכות קטנות של פלסטיק שעשויה להיות על פני השטח שלהם על ידי פיצוץ גז חנקן טוהר גבוה במיוחד על כל שקופית. מניחים את המספר הרצוי של שקופיות, צד מצופה למעלה, על הבמה arrayer.
    3. תכנת את arrayer, השתמש בפרמטרים של 27 נקודות בכל ביקור לצלחת מקור, באמצעות 3 "טרום כתמים" על גבי שקופיות מצופה פולי- L- ליזין, כדי להסיר עודפי נוזלים על קצה סיכות הדפסה
      1. הפעל MPU (יחידת כוח ראשית) יחידת בקרת האקלים. התוכנה להרחיב ניתוח ריצוף במחשב.
      2. פריסה בחר את האותיות. בחרו כלי פין אפשרויות → לשמש להדפסת כלי הדפסת המערך 1 x 1 - 1 סיכה אחת. בחר בכרטיסייה יעד → Definition מערך כלי → תבנית הדפסה ולהוסיף המגרש (spot-אל-המקום מרחק), מספר שורות ועמודות כדי להכיל דגימות שיודפס, ואת תבנית ההדפסה של דגימות (עבור מערך זה 8 8 x דפוס הדפסה משמש ב 340 מיקרומטר מגרש עבור 7 מכלל דגימות).
      3. בחר פריסת שקופיות יעד → ולתכנת את מרחק בלוק ל-בלוק כדי לאפשר הדפסה של כל מערך לשכפל לתוך תבנית שקופית 48-היטב (4 x 12). בחר מקור ולהוסיף מספר טנדרי מקור (1 עבור כל דגימה בעת שימוש 1 פינים) (עבור טנדרי מקור הדפסת 7 זה ישמש כדי להכיל 6 בארות מדגם סמן צבע 1 היטב).
        הערה: מקור הדיאלוג צריך להפוך לירוק כדי להראות כי המספרביקורי מקור תואמות את הדגימות שתודפסנה בדפוס ההדפסה.
      4. בחר פלייט מתאם → יעד וחלק פריסה ולהתאים את מספר השקופיות (5 מגלשות מודפסות בכל פעם עבור בהדפסה עם שקף 1 תצפית מראש).
      5. שחרר את המגש על ידי לחיצה על כפתור T1 כדי להפעיל את המגש ולהוסיף את המספר הרצוי של שקופיות למגש, הקדשת תשומת לב למקומות של השקופית מראש התצפית (הכחולה) "אמיתיות" שקופיות.
      6. מניח שקופיות זכוכית רגילות על כל יציאות הוואקום הנותרים לחסום את החלל ולחץ על אישור כדי להפעיל את הוואקום. בדוק שכל השקופיות מוחזקות במקום ולחץ על אישור כדי להחזיר את המגש למיקום הביתה.
      7. טען את צלחת ההדפסה לתוך מחזיק הצלחת ולהבטיח המדף הוגדר כראוי במקום. לחץ GO ולאפשר את תהליך ההדפסה כדי להמשיך.
    4. הדפס את 24 הנקודות שנותרו משכפל של 6 נקודות לכל מערך (4 מערכים / מקור הביקור).
    5. טען את 384 גם הצלחותלתוך המדפסת להתחיל בהדפסה. לשמור על לחות יחסית, במהלך ההדפסה, ברחבי ההדפסה בין 55 ו -65%. המדפסת מפסיקה לאחר הדפסת 5 שקופיות.
      הערה: בעוד microarray assay זה מודפס בדפוס 8 x 8 ספציפי, רובוטי הדפסת microarray שונים ידרשו תכנות ציוד ספציפי כדי להשיג את הפריסה הרצויה. זה תלוי למשתמש הקצה כדי לקבוע את הדפוס המתאים ביותר בהתחשב מפרט הציוד שלהם.
  3. לחות / משתקות
    הערה: לאחר שקופיות סיום הדפסה, הם עוברים שלב קיבוע זמני, גם humidifying שנקרא. Humidifying-הדפסה פוסט עוזר homogenize את הקובץ המצורף מדגם ידי מחדש להרטיב את הנקודות ולהבטיח חסימה מלאה.
    1. שים שקופיות בתא לחות 100% מיד לאחר ההדפסה לתקופה של 30 דק '. לבנות את החדר על ידי צבת מגבות נייר רטובות מאוד שטוחות בחלקו התחתון של צלחת זכוכית גדולה, צבת השקופיותעל איזה מדף, כגון למעלה בצד מתלה מבחנה, הדפסה, ואיטום בניילון נצמד כדי ללכוד את הלחות.
    2. מספר המחליק עם אלכוהול / עט חנות עמידות ממסים סימון בקופסא התייבשות. לייבש לילה.
  4. מספור, חסימה, ואחסון
    1. הכן את החיץ חסימה - 50 מ"מ ethanolamine ב 50 מ"מ חיץ borate. ראשית, לפזר חומצה בורה, DDH 2 O, לריכוז סופי של 50 מ"מימ בבקבוק המכיל בר ומערבבים מגנטי. מערבב את הפתרון נמרצות על צלחת ערבוב עד שכל המוצק נמס. תוך ערבוב מתמיד, להוסיף את הכמות המתאימה של ethanolamine מפתרון 16.54 M המניה להגיע 50 ריכוז מ"מ הרצוי. הוספת סודיום הידרוקסיד מרוכז להסתגל pH הסופי של 9.2.
    2. לטבול את השקופיות מודפסות הפתרון למאגר החסימה עבור שעה 1.
    3. בעקבות 1 hr, לשטוף את שקופיות DDH 2 O כדי להסיר כל עקבות עודפות של חיץ חסימה.השלך חיץ חסימה מיכל פסולת מתאימה.
    4. העברת שקופיות לבעלי מכתים זכוכית ספין יבש. מערכים יבשים על ידי הצבה בצנטריפוגה מצוידת מחזיקי צלחת מתנדנד, במהירות של 10 XG במשך 5 דקות.
    5. לאחר השקופיות הן יבשות, הם יכולים להיות מודגרות מייד או שומרים אותו. תנאי אחסון הם -20 ° C בתוך שקית פלסטיק אטומה.

2. ניתוח חלבונים מחייב glycan

  1. הכינו תא humidified שבו מערכים להיות הכלאה יתאים. חדר פשוט מורכב תבנית פיירקס, שכבתי בתחתית עם מגבות נייר לחות ו מתל, שעליו השקופיות תנחנה.
  2. השתמש לקטינים biotinylated SNA (agglutinin סמבוקה nigra) ו ECA (Erythrina cristagalli agglutinin) ב 10 מיקרוגרם / מ"ל + 2 מיקרוגרם / מ"ל של צבע streptavidin-555, ב חיטוט חיץ (PBS + 0.01% Tween-20). עבור HA (A / וייטנאם / 1203/04 H5N1 ו- A / KY / 07 H1N1, בדוגמה זו), שימושריכוז התחלתי של 20 מיקרוגרם / מ"ל מראש ומורכבת, כפי שתואר לעיל 34. בקצרה, לעשות HA: עכבר-α-סטרפטוקוקוס: תערובת עיזים-α-עכבר-Alexa647 בחסימת המאגר (PBS + 3% BSA + 0.01% Tween-20), בכל 4: יחס טוחנת 1: 2.
    הערה: המערך ומישש עם לקטינים כדי לוודא גליקנים הם משותקים ו לגילוי (איור 1B).
  3. מעבירים את הפתרון לערבב חלבון-נוגדן מחייב glycan של 20 μl לצלחת 384 גם לדגור על קרח למשך 30 דקות. סדרתי לדלל לקטינים ו HA דגימות 1: 1, במאגר שלהם מתאימה, 8 פעמים, על ידי ערבוב 10 μl של המדגם עם 10 μl של חיץ.
  4. פיפטה 8 μl של המדגם על פני השטח מיקרו-היטב דגירה של humidification אטום (100% לחות יחסית) תא במשך 90 דקות.
  5. שטפו את השקופיות אחד בכל פעם על ידי לחיצה על בקצוות טבילתם ארבע פעמים בתערובת של PBS ו 0.05% Tween, אז ארבע פעמים PBS, ולבסוף ארבע פעמים deionized H 2 O. שימושבאותו פרוטוקול הייבוש שמתואר בשלב החסימה, לסובב את המערכים לייבש בצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10 x ז.

3. ניתוח סריקת נתונים

הערה: microarrays glycan ניתן לסרוק על הגדרות שונות, בהתאם ליצרן של סורק microarray. על ידי שינוי כוח לייזר רזולוציה, המכשיר יכול לייצר תמונה עם אותות רבים ככל האפשר בתוך הטווח הדינמי שלה (תרשים 1C).

  1. השתמש בסורק שקופיות פלורסנט ולסרוק את המערכים מייד לאחר דגירה עם החלבונים המחייבים glycan. תשמור על מנת להבטיח את השקופית מוכנסת כהלכה לתוך מכשיר הסריקה.
    1. תוכנת סריקה להרחיב. לחץ על התחל כדי לפתוח את התוכנית. להתחבר סורק: Connect → סורק או כפתור ירוק 'מתפריט החלונית ניווט סורק.
    2. דלת autoloader להרחיב של הסורק. מניח שקופיות חריצי autoloader בסדר מסוימים. דלת autoloader סגורה. Clאיכס "לקרוא מטעין" בחלונית ניווט כלים לזהות אוטומטית שקופיות הסורק.
    3. גדר פרמטר סריקה: פרמטרי סריקת → הסורק מתאימים הניסוי (למשל 635 כוח הליזר גבוה, רווח זיהוי 50%). שקופיות סריקה: סורק → סריקה. בחר נתיב-ידי יצירת תיקייה לשמור את תמונות סריקה וסריקות בודדות שם. האם לפני זה כדי הסריקה בפועל. חזור על הפעולה עבור כל שקופית הפרט. לחץ על אישור כדי להתחיל בסריקה.
  2. השתמש בתוכנת הסורק כדי להגדיר את המכשיר לסרוק את השקופיות. סורק הגדר כדי לסרוק באופן איטרטיבי בהספק לייזר נמוך (5 mW) עם חיזוק הגדרות רווח של 25%, 50% ו -75%.
    הערה: ההגדרות תוכלנה להיבדק ולקבל טיפול מותאם, אך יש לזכור כי כל סריקה יכולה להפחית את תפוקת הקרינה של הצבעים בשל photobleaching.
    1. רכישת תוכנת ניתוח נתוני פתיחה כגון תוכנות Mapix. לחץ על התחל כדי לפתוח את התוכנית. התמונה הסרוקה להרחיב: קובץ → im פתוחגיל. קובץ GAL להרחיב: נתח → רשת פתוחה ובחר בקובץ GAL המתאים.
    2. הזן בלוקים מצב: תמונה → בלוקים מצב להזיז את הרשת. השתמש בסמנים ברשת כדי להגדיר את הרשת אל המיקום המתאים בשקופית. התאם בלוקים בודדים לפי צורך להתאים את המערך המודפס.
    3. זן כתמי מצב: תמונת → מצב כתם להתאים מיקום וגודל של מקומות מסוימים בתוך הבלוק. לאחר כל אבני כתמים מותאמים ובמקום, עוצמות אות מידה ידי לנתח חישובים photometric →. שמור את קובץ הפלט.
  3. לאחר השקופיות סיימו סריקה, תמונות מנותחות לכריכת אותות עם תכנית עיבוד תמונה המותקנת (האיור 1D - G). לניתוח תמונה, לטעון קובץ GAL (רשימת Array) מעל התמונה TIFF סרק.
    הערה: קובץ GAL מכיל הוא את דפוס פריסת ספוט זהותם של כל מיקום נקודה. קבצי GAL עבור מערכים הם created ידי תוכנת המדפסת באמצעות קובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים המכיל את זהותם של דגימות ומיקומם בצלחת מקור 384 גם.
  4. השתמש אורות רשת סמן / נחיתה מודפסים על microarrays למקם את רשת GAL כראוי. מקומות מסוימים ייתכן שיהיה צורך להתרגש בנפרד, אלא מערך מודפס היטב יאפשר בדרך כלל בלוקים בתוך הרשת להציב בקלות. בעקבות מיקום הרשת, לאסוף עוצמות במקום על ידי התוכנה והציל כקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים (.txt).
    1. באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים, לפתוח את קובץ הפלט מהסורק. פתח את קובץ מאקרו המתאים ממיקום התיקייה. לחץ על הצג → מאקרו → RunMacro.
      הערה: כתובה מראש יעתיק את נתוני תפוקת גלם, להסיר שורות ועמודות מיותרות, למיין הנתונים לפי מדגם, לחשב את ערכי רקע מינוס אות תוחלת הממוצעים ואת העלילה ערכי הנובע ממנו אל גיליון עבודת התפשטות גיליון המכיל את הגרפים עבור כל מששת samples נבדק על המערך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדפסה, סריקה & Data מנתח

כדי להבטיח הדפסה נכונה, זה חיוני כדי לקבל את היישור הנכון של הרשת הבחינה בתוך מסכת הטפלון, המתווה כל מערך בשקופית. במהלך ההדפסה, בשל האופי של ציפוי טפלון, כתמים שלא ניתן לראות בעין בלתי מזוינת בשקופיות MPX. תשומת לב מוקדשת ואז הופעת הכתמים מראש בשקופיות פולי- L- ליזין המצופות. מייד לאחר הדפסה, כל שקופית צריכה להיבדק על ידי עין לנוכחות של כל מתחם הבחין כי הוא גלוי בשל המלחים של למאגר המיובש במקום. מערכים נבדקים על יישור נכון של כתמים בגבולות הטפלון המספר נכון של תכונות הבחינו.

שקופיות נסרקות תהליך חוזר ונשנה של התחתון לשלטון סריקה גבוה כדי למנוע הלבנת תמונה המאפשר השוואה של בפוהלהיטות ממנה להנמיך חלבוני מחייב להיטות, אשר יש יותר ויותר אותות תפוקה נמוכים, בהתאמה. בעקבות סריקה, עוצמת הניאון של כל נקודה ונקודה בתמונות הפלט נמדדת באמצעות תכנית הדמיה. מערך כל יכסה עם קובץ לרשת התואמת את מספר התכונות מודפסות על פני שטח המערך (1D איור - G). באמצעות צבעי ניאון מודפסים, הגבולות של גליקנים מודפסים מוגדרים ומסכה כי היא משולבת עם הזהות של המדגם מודפס lassoes כל נקודה. מסכת ההדמיה לאסו תתעד את כל ההיבטים של מקום ההדמיה (גודל, עוצמת אות, קואורדינטות ברשת, וכו ') ופלט המידע הזה לקובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים. באמצעות תוכנת לווח (גיליון אלקטרוני), הדגימות מסודרות על ידי זהות ואת עוצמת האות הממוצעת מינוס רקע בממוצע לכל 4 מתוך 6 הנקודות עבור כל דגימה, משמיטה את האות הגבוה ביותר והנמוך ביותר כמו חריגים. גרף קו של אות ממוצעת ממוצעתרקע מינוס זמם נגד השמונה ריכוזי החלבון להחיל את המערך ומכיל שורה אחת עבור כל דגימה. גרף הפלט הסופי מוחלק באמצעות חישוב רגרסיה שאינו ליניארי (איור 1 ט).

Glycan מחייב חלבונים

The-Array PAA משמש כדי להעריך סגוליות מחייב לקולטן של שפעת A hemagglutinins וירוס. מאפיין נוסף של המערך שלנו, לא נוכח assay הצלחת המקביל, הוא ההכללה של בקרות שאינן sialylated באותה מייקרו-היטב. כדי להעריך כי תרכובות מודפסות נוכחים לאחר הדפסה, צמח נפוץ לקטינים עם סגוליות ידועות שמשו. ECA נקשר גלקטוז מסוף מקושר β1-4 כדי N- אצטיל-גלוקוזמין (Galβ1-4GlcNAc או LacNAc) ולא לאגד אם גלקטוז המסוף כתרים עם חומצה sialic. ECA רק מזהה את גליקנים הלא sialylated על arr glycan מיניאטורי שלנואיים (איור 2 א). העדר מחייב לכל מדגימות glycan sialylated הוא גם מעיד כי אלה הם כתרים מלאים עם חומצת sialic סופנית. לקבלת α2-6 חומצה sialic צמוד, SNA שימש כביקורת לקטינים (איור 2 ב). כצפוי, SNA נקשר רק α2-6 מקושרות חומצות sialic, אבל עם הבדלים ראויים לציון ב זיקה צמודה PAA חזרות di-LacNAc הלא צמודות PAA. פער זה משקף את הרגישות של גליקנים צמודים PAA ומאפשר אפלית חלבונים שעשויים להיקשר עם להיטות נמוכה. לקבלת α2-3 חומצה sialic צמוד, גידול hemagglutinin H5 נגזר A / וייטנאם / 1203/04 וירוס כי ידוע להכיר α2-3 חומצות sialic מקושר היה בשימוש רק 6. הפרופיל המחייב של H5 HA אכן מראה וספציפי α2-3 חומצות sialic צמודות, עם להיטות גבוהה עבור מבני PAA-הצמודים (איור 2 ג). לבסוף, hemagglutinin H1 מן הזן אנושי עונתי H1N1 שמש כי, כצפוי, רקכבול α2-6 המכיל מבני sialic חומצה צמודים (2D איור).

איור 1
איור 1: הדפסה, סריקה ותמונה מנתח (א) 6SLNLN PAA מצומדות מוצג כמבנה glycan נציג כי הוא מודפס על שקופיות הזכוכית.. (ב) קבוצה מתחיל חלבון glycan מחייב על מערך glycan רב גם מוצג עם נפח 8 μl שיוצר אגל על פני שטח המערך. (ג) לאחר דגירה של החלבונים המחייבים glycan על המערך והסריקה בתוך סורק שקופיות פלורסנט confocal, תמונה מייצגת מתקבלת. (D) התמונה תכסה עם שני וערב, באמצעות סמני רשת עבור יישור תקין, ניתן לנתח את הנקודות היחידות. (E) תקריב של סט שלם של 8 מערכים, שבה חלבון מחייב glycan יחידנותח באמצעות שמונה 1: 1 דילולים. (F) מערך יחיד, בתוך באר אחת מיוצגת; המערך יהיה demarked ידי סמני הרשת בפינה הימנית העליונה (3 נקודות) ואת השמאלית תחתונה (2 נקודות), חלבון מחייב glycan זה נקשר תרכובת אחת על המערך בתור לשכפל של שישה נראה בבירור. (G), הגריד מוצג עם lassos המקיפה מקומות מסוימים ספציפיים. (H) הדמית תוכנת מחשבת ערכי אות מקובץ תמונת פלטי קובץ נתונים מופרדים באמצעות טאבים. (I) ניתן נספרים הנתונים בגיליון או תוכנת stastical כדי ליצור גרף פלט נציג. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: פלט של לקטינים צמח (ECA, SNA) ו IAV המהgglutinins עם ספציפיות שונות (H5 מ- A / וייטנאם / 1203/04, H1 מ- A / קנטאקי / 07). (א) ECA נקשר LacNAc מסוף או Galb1-4GlcNAc ספציפי מזהה נוכחות של תרכובות אי-sialylated, לשמש שולטת עבור hemagglutinins IAV. (ב) SNA מכיר רק גליקנים ועליו חומצה sialic α2-6 סופנית. (ג) hemagglutinin רקומביננטי של H5N1 (A / וייטנאם / 1203/04) זן נקשר α2-3 חומצות sialic ומספק פרופיל מחייב קולטן מסוג העופות. (ד) hemagglutinin רקומביננטי של H1N1 עונתית האדם (A / קנטאקי / 07) נקשר לקולטנים מסוג האנושי בלבד. עוצמת האות פלורסנט נמדדה על כל מקום, ולהתכוון עוצמת מינוס מתכוון רקע משתמש מחושב תוכנת גיליונות אלקטרוניים. עבור כל glycan, עוצמת האות הממוצעת מחושבת 6 משכפל כתמים. האותות הגבוהים והנמוכים של 6 משכפל יוסרו הנותרים 4 העתקtes משמש לחישוב האות הממוצע, סטיית תקן (SD), ומדידת סטיית התקן (SEM). הגרפים מייצגים את רקע מינוס אות הממוצע בממוצע לכל ברי מדגם וטעייה הם ערך SEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הערכה סגולית הקולטן IAV היא צעד חשוב בניתוח פוטנציאל מגיפת וירוסי עופות. הכרת חומצת sialic ידי הנגיף קשור לכמה מאפיינים ביולוגיים כגון קשירה ושחרור מהתא. ידיעה אשר מוטציות-חומצת אמינו נחוצות וירוסי עופות להשיג α2-6 מחייבים ולחצות את מחסום המינים מאפשר מוכן לקראת מגפה. מבחנים כמה משמשים כדי לקבוע סגוליות הקולטן; יש עם זאת, כל החסרונות שלהם, כולל להיטות מדידה בלבד ולא סגולי ולהיפך.

כאן אנו מתארים כלי רומן מיניאטורי מבוססים על שימוש נרחב ומקובל ELISA, אשר משתמש שברי מסוף צמוד PAA של גליקנים מורכבים יותר. השימוש מוגדר היטב 4 לקטינים, 2 של מפעל ו -2 של שפעת A ממוצא וירוס, אנו מראים כי אנחנו שומרים על סגוליות להיטות יחסית.

כאשר אנו מחשבים את כמות ההקטנה של כימיקלים biologiCal שמוצג miniaturizing ELISA על גבי שבב מערך glycan, נגיע הבדלים גדולים להפליא. ראשית, ביולוגיות; אנו משתמשים נפח assay פחות 10x ולהשתמש 6 תרכובות בדיקה ב 6 משכפל; זה יכול להיות מחושב כדי להיות שווה ערך של 36x שורות 96-גם הצלחות. התוצאה היא כי אנו משתמשים 360x ביולוגיים פחות. צעדים קריטיים כוללות הדפסה נכונה את הסיכון מרקע כלכלי גבוה באמצעות סוכנים מחייב glycan unpurified או נוגדנים גילוי עניים.

התרכובות המשמשות assay זה, אם כי עדיין זמין, אינן עשוי בקלות בסינתזת האנזימטית הכימותרפיה. שימוש בטכנולוגיה microarray-דפוס, כל נקודה היא רק 2 NL, לעומת 100 μl לכל גם צלחת microtiter. הדפסת שקופיות יחיד המכיל 48 בארות 6 תרכובות, ב 6 משכפל, שאנו צורכים כ 1,152 NL. הליך הציפוי אותו בתוצאות צלחות 96-היטב ציפוי סך של 1,842 בארות עם 100 μl של מתחם באותו הריכוז. לכן, הדפסה tהוא מתחם לעומת assay הצלחת, אנו משיגים הפחתה מובהקת 1,500x. לכן, בסך הכל, ביולוגיות מופחתות 360 פי וצריכת glycan ב -1,500 פי. באמצעות מטפלי נוזלי רובוטית, אנו צופים כי מרבית הפעולות יכולות להיות אוטומטיות, המאפשרות assay כולו לשמש כמסך תפוקה גבוהה.

למרות microarrays ההדפסה וניתוחי תמונה הבאים דורשים מכונות וכלים מיוחדים, מכשירים אלה אינם נדירים נוכחים באוניברסיטות רבות ומכונים. הדפסה ישירה ואינו דורש שינויים כימיים. לכן, אנו מאמינים כי, עם כמות מינימאלית זו של תרכובות וטכניקת הדפסה פשוטה, assay זה יכול להיות כללי יותר ישים. כפי שהיא מקטינה את נפח הדגירה, העלויות של נוגדנים וביולוגיה יקרה, טכניקה זו תהפוך את זה אפשרי עבור מעבדות עם משאבים מוגבלים כדי להעריך סגולי של IAV או חלבונים מחייבים glycan אחרים עם איכות גבוהה תוך השמירה על עלות נמוכה יותרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מתקן Core Microarray סקריפס, וחוזה מן המרכז לבקרת מחלות (JCP). RPdV היא כלת מענק הרוביקון ו Veni מההסתדרות הולנד למחקר מדעי (NWO). המאגד עבור glycomics פונקציונלית (http://www.functionalglycomics.org/) במימון NIGMS מענק GM62116 (JCP) סיפק כמה גליקנים השתמשו במחקר זה. זהו פרסום 29,113 ממכון המחקר סקריפס.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NEXTERION® Slide H MPX-48  Schott 1091525 Microwell slides
ProScanArray Plus  PerkinElmer discontinued confocal microarray scanner
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software Innopsys - confocal microarray scanner
MicroGrid II  Digilab - microaray printer
SNA Vector Labs B-1305  Plant Lectin
ECA Vector Labs B-1145  Plant Lectin
Anti-Strep Antibody IBA 2-1509-001  Anitbody for HA binding
Anti-Mouse Alexa-647 Life A-21235 Anitbody for HA binding
Tween-20 Sigma P2287  detergent
di-basic Sodium Phosphate Sigma 255793 printing buffer component
mono-basic Sodium phosphate Sigma 229903  printing buffer component
poly-l-lysine solution Sigma P8920  pre-spotting slide component
sodium hydroxide Sigma 221465 pre-spotting slide component
ethanol Sigma 493546 pre-spotting slide component
phosphate buffered saline Corning 46-013-CM incubation/washing buffer
SMP4B pins Telechem SMP4B printing pin
Compressed Nitrogen (Grade5) Praxair UN1066 general dusting/drying tool
Boric Acid Sigma B6768-500G Slide blocking reagent
ethanolamine Sigma E9508-500ML Slide blocking reagent
Atto 488 AttoTec AD 488-91 Gridmarker on array
PAA-LNLN Consortium for Functional Glycomics PA368 Spotted glycans
PAA-3SLNLN Consortium for Functional Glycomics PA362 Spotted glycans
PAA-6SLNLN Consortium for Functional Glycomics PA343 Spotted glycans
LNLN Consortium for Functional Glycomics Te98 Spotted glycans
3SLNLN Consortium for Functional Glycomics Te175 Spotted glycans
6SLNLN Consortium for Functional Glycomics Te176 Spotted glycans
384-well microtiter plate Matrix TechCorp 4361 Printing plate
VWR lab marker VWR 52877-150 Slide Numbering
Wheaton slide staining dish Sigma Z103969-1EA Blocking and Drying

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tumpey, T. M., et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission. Science. 315 (5812), 655-659 (2007).
  2. Xu, R., et al. Functional balance of the hemagglutinin and neuraminidase activities accompanies the emergence of the 2009 H1N1 influenza pandemic. J Virol. 86 (17), 9221-9232 (2012).
  3. Bouvier, N. M., Palese, P. The biology of influenza viruses. Vaccine. 26, Suppl 4. D49-D53 (2008).
  4. Freidl, G. S., et al. Influenza at the animal-human interface: a review of the literature for virological evidence of human infection with swine or avian influenza viruses other than A(H5N1). Euro Surveill. 19 (18), (2014).
  5. Xu, R., et al. Preferential recognition of avian-like receptors in human influenza A H7N9 viruses. Science. 342 (6163), 1230-1235 (2013).
  6. Paulson, J. C., de Vries, R. P. H5N1 receptor specificity as a factor in pandemic risk. Virus Res. 178 (1), 99-113 (2013).
  7. Tzarum, N., et al. Structure and receptor binding of the hemagglutinin from a human H6N1 influenza virus. Cell Host Microbe. 17 (3), 369-376 (2015).
  8. Zhang, H., et al. A Human-Infecting H10N8 Influenza Virus Retains a Strong Preference for Avian-type Receptors. Cell Host Microbe. 17 (3), 377-384 (2015).
  9. Carroll, S. M., Higa, H. H., Paulson, J. C. Different cell-surface receptor determinants of antigenically similar influenza virus hemagglutinins. J Biol Chem. 256 (16), 8357-8363 (1981).
  10. Gambaryan, A. S., et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human H1 and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6'-sialyl(N-acetyllactosamine). Virology. 232 (2), 345-350 (1997).
  11. Rogers, G. N., D'Souza, B. L. Receptor binding properties of human and animal H1 influenza virus isolates. Virology. 173 (1), 317-322 (1989).
  12. Rogers, G. N., et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity. Nature. 304 (5921), 76-78 (1983).
  13. Paulson, J. C., Rogers, G. N. Resialylated erythrocytes for assessment of the specificity of sialyloligosaccharide binding proteins. Methods Enzymol. 138, 162-168 (1987).
  14. Paulson, J. C., Sadler, J. E., Hill, R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoerythrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases. J Biol Chem. 254 (6), 2120-2124 (1979).
  15. Chutinimitkul, S., et al. In vitro assessment of attachment pattern and replication efficiency of H5N1 influenza A viruses with altered receptor specificity. J Virol. 84 (13), 6825-6833 (2010).
  16. Glaser, L., et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity. J Virol. 79 (17), 11533-11536 (2005).
  17. Herfst, S., et al. Airborne transmission of influenza A/H5N1 virus between ferrets. Science. 336 (6088), 1534-1541 (2012).
  18. Nobusawa, E., Ishihara, H., Morishita, T., Sato, K., Nakajima, K. Change in receptor-binding specificity of recent human influenza A viruses (H3N2): a single amino acid change in hemagglutinin altered its recognition of sialyloligosaccharides. Virology. 278 (2), 587-596 (2000).
  19. Gambaryan, A. S., Matrosovich, M. N. A solid-phase enzyme-linked assay for influenza virus receptor-binding activity. J Virol Methods. 39 (1-2), 111-123 (1992).
  20. Totani, K., et al. Chemoenzymatic synthesis and application of glycopolymers containing multivalent sialyloligosaccharides with a poly(L-glutamic acid) backbone for inhibition of infection by influenza viruses. Glycobiology. 13 (5), 315-326 (2003).
  21. Gambaryan, A., et al. Receptor specificity of influenza viruses from birds and mammals: new data on involvement of the inner fragments of the carbohydrate chain. Virology. 334 (2), 276-283 (2005).
  22. Ito, T., et al. Receptor specificity of influenza A viruses correlates with the agglutination of erythrocytes from different animal species. Virology. 227 (2), 493-499 (1997).
  23. Watanabe, Y., et al. Acquisition of human-type receptor binding specificity by new H5N1 influenza virus sublineages during their emergence in birds in Egypt. PLoS Pathog. 7 (5), e1002068 (2011).
  24. Chandrasekaran, A., et al. Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin. Nat Biotechnol. 26 (1), 107-113 (2008).
  25. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  26. Childs, R. A., et al. Receptor-binding specificity of pandemic influenza A (H1N1) 2009 virus determined by carbohydrate microarray. Nat Biotechnol. 27 (9), 797-799 (2009).
  27. Nycholat, C. M., et al. Recognition of Sialylated Poly-N-acetyllactosamine Chains on N- and O-Linked Glycans by Human and Avian Influenza A Virus Hemagglutinins. Angew Chem Int Ed Engl. , (2012).
  28. Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
  29. Song, X., et al. A sialylated glycan microarray reveals novel interactions of modified sialic acids with proteins and viruses. J Biol Chem. 286 (36), 31610-31622 (2011).
  30. Gulati, S., et al. Human H3N2 Influenza Viruses Isolated from 1968 To 2012 Show Varying Preference for Receptor Substructures with No Apparent Consequences for Disease or Spread. PLoS One. 8 (6), (2013).
  31. Stevens, J., Blixt, O., Paulson, J. C., Wilson, I. A. Glycan microarray technologies: tools to survey host specificity of influenza viruses. Nat Rev Microbiol. 4 (11), 857-864 (2006).
  32. de Vries, R. P., et al. Evolution of the hemagglutinin protein of the new pandemic H1N1 influenza virus: maintaining optimal receptor binding by compensatory substitutions. J Virol. 87 (24), 13868-13877 (2013).
  33. Yang, H., et al. Structure and receptor binding preferences of recombinant human A(H3N2) virus hemagglutinins. Virology. 477, 18-31 (2015).
  34. de Vries, R. P., et al. The influenza A virus hemagglutinin glycosylation state affects receptor-binding specificity. Virology. 403 (1), 17-25 (2010).

Tags

אימונולוגיה גיליון 111 glycan-מערך חומצה sialic פולי-acrylamide (PAA) שפעת hemagglutinin לקטינים גלקטוז LacNAc
Assay Microarray מיניאטורי glycan להערכת הלהיטות וספציפיות של Hemagglutinins וירוס שפעת A
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McBride, R., Paulson, J. C., de… More

McBride, R., Paulson, J. C., de Vries, R. P. A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins. J. Vis. Exp. (111), e53847, doi:10.3791/53847 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter