유전자 전사의 미세 조정 규정은 배아 세포 운명 결정의 기초가. 여기서, 우리는 줄기 세포와 마우스 배아 심장 개발 모두 심장 분화의 후생 유전 학적 조절을 조사하기 위해 사용 염색질 면역 침전 분석법을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
특정 유전자 전사는 배아 개발하는 동안 세포 운명 결정의 기초가 중요한 생물학적 과정이다. 생물학적 공정은 증강 및 심근 구성 적 유전자의 프로모터를 포함 유전자 조절 영역을 결합 전사 인자에 의해 매개된다. DNA는 화학적 변형을 실시한다 히스톤 주위에 싸여있다. 히스톤의 수정은 추가하여 유전자 전사의 미세 조정 규제의 또 다른 레벨을 가져, 활성화, 억압 또는 태세 유전자 전사로 이어집니다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)가 심장 개발의 초기 단계에 배양체 (즉, 세포 집합체) 내에 또는 2D 배양 요점을 되풀이. 그들은 염색질 면역 침전 (칩)를위한 원칙 충분한 재료 제공, 기술은 크게 유전자 조절 영역을 식별하는 데 사용. 또한, 인간 ES 세포 cardiogenesis의 인간 세포 모델을 나타낸다. 개발의 나중 단계에서 마우스 배아 조직을 허용셀 정체성 결정에 필요한 특정 후생 유전 학적 풍경을 조사. 여기서, 우리는 PCR 또는 ES 세포, 배아 체 심장 특정 배아 영역을 사용하여 칩 시퀀싱 뒤에 칩, 연속 칩의 프로토콜을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 심장 유전자 전사의 후생 유전 학적 조절 조사를 할 수 있습니다.
서론
심장은 제 장기가 형성 될 상기 배아 기능하게하는 것이다. 심장은 제 1 및 제 2 배아 심장 필드 1에서 발생하는 많은 세포 계통에서 만들어집니다. 후 시비 배반포는 모양의 마음까지 무대에서 배아 세포는 많은 세포 운명 결정을하는 것이 있습니다. 유전자 전사는 시간과 공간에 의존하는 방식으로 규제 및 배아 개발하는 동안 세포 운명 결정의 기초가 중요한 생물학적 과정이다. 이러한 공정은 증강 및 심근 구조적 유전자의 프로모터를 포함하는 게놈 내에서 조절 영역을 특정 결합 전사 인자에 의해 매개된다. DNA는 예컨대 아세틸 화, 메틸화, ubiquitinylation 및 / 또는 인산화와 같은 변형을 실시 히스톤 감싸된다. 히스톤 변형 히스톤의 리신 잔기 (2) 개질 된 따라 활성화 또는 억압 태세 유전자 전사를 이끈다.
jove_content "> 염색질 면역 분석법 (칩) 년전 3 설정된 가장 광범위하게 사용되는 기술은 수정 된 히스톤 또는 전사 인자 4. 히스톤 또는 전사 인자의 면역 따라 하나의 타겟을 식별하기 위해 현재, 결합 된 DNA 일 수있다 어느 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭 또는 염기 서열. 칩은 기술적으로 어려운 겔 지연 분석법 (5)를 극복하....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. DNA 단백질 교차 결합
- ES 세포와 배아 심장 조직에서 생성 된 15 ml의 튜브에 고정 수확-ES 세포 (일반 칩 2 × 10 6 세포, 마이크로 칩 2 × 10 5 세포), 배아 체 (사채)을 E9.5 마우스 배아에서 해부 (방실 운하, 유출 기관 및 뇌실) 세포 또는 배아 조직에 대한 permeabilization의 PB2 버퍼에 PBS에 1 %의 포름 알데히드를 사용하여. 정확히 10 분 동안 실온에서 60 rpm의 속도로 진탕에 튜브를 놓는다.
- 125 mM의 최종 농도 글리신을 첨가하여 가교 반응을 정지하고 60 rpm의 속도로 진탕 기에서 실온에서 5 분 동안 배양한다.
2. 세포 용해 및 염색질 조각화
- PBS 1X 또는 배아 조직을 1 ml의 PB2에 재현 탁 ml의 두 배 (10)에 재현 탁 가교 세포를 씻으십시오. 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
- PB1 또는 PB2 (2 μg의 / ㎖ 류 펩틴, 1 μg의 / ㎖ 아프로 티닌, 0.1 mM의 PMSF) (표 1) 버퍼 프로테아제 억제제를 추가합니다. 각각 버퍼 PB1 또....
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결과
도 1a는 제 DNA 결합 비즈 다른 크기 (1킬로바이트 사다리)의 DNA를 이용하여 품질 관리의 제조를 예시한다. 0ne, 구슬이 2.5 부피 (1 내지 3)는 고 및 저 분자량 크기의 DNA 단편을 정제 할 수있는 샘플의 하나의 볼륨에 첨가 하였다.
도 1 B, C, D는 각각 마우스 ES 세포 또는 배아 체 (25 E9.5 심실 풀링) 배아 심장 영역으로부터 추출한 전체 초음파 DNA로부터 DNA 겔의 전형적인 예이다.
ES 세포는 mesendodermal 후 중배엽 상태 내지 제 심장 세포의 운명을 향해 그들이 전송을 구별하는 경우. 이러한 발달 여행은 상피 세포가 epithelio .......
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토론
후성 유전학이 발달 생물학 연구의 중요한 분야가되고있다. 유전 적 프로그램이 배아 혈통 내에서 특정 ID를 인수로 셀 수 있도록 배아 세포에서 활성화하는 방법을 오랜 시간 동안 발달 생물 학자에 대한 핵심적인 질문이었다.
칩은 크게 마지막 년 이내에 사용 순서의 해상도 향상 다음 DNA 염기 서열에 결합하고있다. 이 넓은 의존적으로 게놈의 셀 또는 특정 배아 및 성인 조직의 후생 유전 학적 풍경을 조사하기 위해 강력한 기술이되고있다. 칩 검정 버퍼와 초음파 조건이 크게 생물학적 물질의 소량에 대한 분석을 허용하도록 향상되었다. 이 미세 절제 또는 형광 기자 단백질을 발현 FACS 정렬 된 세포에 의해 얻어진 배아 마음의 특정 지역을 포함한다. 실제로 칩은 이종의 세포 집단 13 14 캔에서 수행해석하기 어려운 잘못된 결과로 이어집니다. 후생 유전 학적 서명 마크는 매우 정확 인구 셀. 그 서명은 그들에게 차별화의 특정 가능성을 부여하고 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 자금 지원 기관, IMI StemBANCC 유럽 공동체 프로그램, leducq 재단(SHAPEHEART) 및 Agence Nationale de la Recherche(Genopath)에 감사를 표합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 포름알데히드 | 시그마 | F8775 | 세포 고정 |
| Glycine | Sigma | G8898 | 교차 링크 스톱 |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | 프로테아제 억제제 |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | 프로테아제 억제제 |
| PMSF | Sigma | P7626 | 프로테아제 억제제 |
| 단백질 A 자석 비즈 | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI 자석 구슬 | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA 정제 |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | 단백질 소화 |
| DNA BR 표준 | Life Technologies | Q32850 | 교정 범위 |
| Syber green | 분자 프로브 | S-11484 | DNA 정량화 |
| TE 버퍼 | Invitrogen | P7589 | DNA 정량화 |
| PBX 1x | Life technologies | 14190-094 | |
| 세척 DNase RNase 무료 물 | Life technologies | 10977-035 | 희석 |
| Axygen 튜브 | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP 농도 |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µ ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; g: 조직 |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µ ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; g: 조직 |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µ ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; g: 조직 |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µ ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; g: 조직 |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µ ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; g: 조직 |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µ ESC 및 EB의 경우 g, 1 & micro; 티슈의 경우 G |
참고문헌
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet.
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재인쇄 및 허가
