Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Влияние печени засечки на внутрипеченочных опухолевого роста

9.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53946

⸱

9 апреля 2016 г.

 ,  , 
1Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU), 2Department of Surgery, University Hospital Regensburg, 3Department of Surgery, University Hospital Erlangen

В этой статье

Краткое содержание

Высокая частота рецидивов опухоли после резекции метастазов в печени остается нерешенной проблемой. Иллюстрированная мышиная модель может быть полезна для исследования причин таких рецидивов. Он впервые сочетает в себе модель резекции печени с внутрипеченочным введением опухолевых клеток.

Аннотация

Высокая частота рецидива опухоли после резекции метастатического поражения печени остается нерешенной проблемой. Малые опухолевых клеток отложения, которые не могут быть обнаружены с помощью обычной клинической визуализации, может быть стимулировано печеночных факторов регенерации после резекции печени. Это не совсем понятно, однако, какие факторы имеют решающее значение для рецидива опухоли.

Представленная модель мыши может оказаться полезным для изучения механизмов, которые играют определенную роль в развитии рецидивов злокачественных новообразований после резекции печени. Модель сочетает в себе простой в выполнять и воспроизводимые методы определенных количеств удаления ткани печени и индукции опухоли (путем инъекции) у мышей. Животных обрабатывали либо одной лапаротомии, 30% резекции печени, или 70% резекции печени. Все животные впоследствии получили инъекции опухолевых клеток в оставшейся ткани печени. После двух недель наблюдения, печень и опухоли оценивали по размеру и весу иисследовали с помощью иммуногистохимии.

После того, как 70% резекции печени, объем опухоли и вес были значительно увеличены по сравнению с одним лапаротомии (р <0,05). Кроме того, иммуногистохимии (Ki67) показали повышенную скорость пролиферации опухоли в группе иссечения (р <0,05).

Эти результаты демонстрируют влияние печеночных механизмов регенерации на рост внутрипеченочных опухоли. В сочетании с такими методами, как гистологического проработке или анализа РНК, описанная модель мыши могла бы служить основой для тщательного изучения различных факторов, участвующих в росте опухоли и рецидива метастатического заболевания в печени. Значительное число переменных, таких как продолжительность послеоперационного наблюдения, клеточная линия используется для инъекций или сроков инъекции и резекции печени предлагают несколько углов при изучении конкретного вопроса в контексте пост-ГЕПАТЭКТОМИИ метастазов. Ограничения этой процедуры являются а.е.thorization для выполнения процедуры на животных, доступ к соответствующему объекту испытаний на животных и приобретения определенного оборудования.

Введение

Колоректальный рак (CRC) составляет почти 9% от всех злокачественных опухолей. Это является третьим наиболее распространенным видом рака, как в США, так и во всем мире. Глобальные показатели смертности от диапазона CRC от 300000 до более чем 500000 в год 1. Двадцать процентов пациентов страдают от метастазов в печени при обнаружении их колоректального опухоли. Резектабельные метастазы обычно обрабатывают с помощью частичной резекции печени 2,3. Усовершенствованные хирургические методы, новые мультимодальные стратегии и новые определения резектабельными метастазов оказывают терапию частичной резекции печени возможно для все большего числа пациентов 4.

Рецидив вторичных злокачественных опухолей печени, однако, является сложной клиническая sequalae в современной хирургии желудочно-кишечного тракта. Пациенты с КПР, перенесшие резекцию метастазов в печени имеют от 30 до 50% вероятность развития новой опухоли в их остатке печени 5. Таким образом, существует необходимость в проведении дальнейших исследований, посвященныхмеханизмы, участвующие в рецидива метастазов в печени.

Резекция печени около 70%, как правило, компенсируется в течение нескольких недель от оставшейся печеночной ткани. Эта регенерация включает в себя множество механизмов, в том числе цитокинов, таких как интерлейкин 6 (IL-6), фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа), фактор роста гепатоцитов (HGF), трансформирующий фактор роста бета (TGF-бета), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF ), матричные металлопротеиназы (ММР-2 и ММР-9) и СХС-хемокины 6-11. Эти вещества поддерживают регенерации печени и может также нести ответственность за высокий уровень повторяемости первичных и вторичных злокачественных опухолей печени путем стимулирования роста малых месторождений опухолевых клеток в оставшейся печени, которые не обнаруживаются рутинной клинической визуализации. Эта причинно-следственная связь не была доказана до сих пор.

Установлена ​​следующая гипотеза. После частичной резекции печени, факторы распространения, которые несут ответственность за живоеR гипертрофия может также вызвать рост ранее неоткрытых опухолевых клеток в печени. Модель мыши была разработана, которая совместила техники резекции печени и индукции опухоли. Тридцать бестимусных голых-foxn1nu / Nu мыши были разделены на три группы по десять животных в каждой. Каждый из них обрабатывали только либо лапаротомии (группа А), 30% резекция печени (группа В) или 70% резекцию печени (группа С). Животные во всех группах впоследствии получили инъекции опухолевых клеток в определенной оставшейся части печени, чтобы имитировать покоящиеся клетки опухоли. Животные, где наблюдали в течение двух недель, а затем оценивали на предмет роста опухоли и гипертрофии печени.

Цель состояла в том, чтобы создать модель, которая может быть использована для поиска молекулярных и патогенетические факторы, которые могут играть определенную роль в формировании после гепатэктомии опухоли. Этот метод может быть полезным при оценке: происхождение эндокринных факторов, участвующих в регенерации печени; ответственные механизмы внутрипеченочного ТУМили рост после резекции печени; а объем резекцию печени необходимо для внутрипеченочного индукции опухолевого роста. Следующий метод только выполнялась на животных, потому что они обещают внести свой вклад в понимание фундаментальных биологических принципов и развитие знаний, которые можно ожидать в пользу людей от улучшенных вариантов лечения. Из - за механизмов , участвующих в этих вопросах, оно должно было быть рассмотрено в естественных условиях, так как методы в пробирке не может обеспечить реалистичное представление патологии человека.

Эти исследования могут привести к открытию соответствующих целевых задач для профилактических вариантов лечения для уменьшения рецидива опухоли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Правительство Средней Франконии в Баварии, Германия, получила разрешение для процедур, описанных. Любые подобные эксперименты требуют предварительного разрешения соответствующих властей.

Примечание: Следующая Пособие может быть использовано для рассмотренных ранее групп А через C. Шаги, которые должны быть оставлены в группах А и В имеют соответствующую маркировку.

1. Подготовка

  1. Наденьте перчатки, поместите полистирола площадку под микроскопом, и сфокусировать объектив на область чуть выше площадку.
  2. Разделить стерильную простыню и место половину по сравнению с полистиролом площадку, а другая половина просто рядом с ним.
  3. Стерилизовать хирургических инструментов и поместите их на стерильную листе рядом с Полистирол площадку.
  4. Отогните большой скрепку, чтобы сформировать арку. Поверните его вверх дном и нажмите на него в полистирольной площадку на верхнем конце - только рядом, где голова животного будет лежать.
  5. Поместите мундштук испарителем между двумя конечностиs арки. (Рисунок 7)
  6. Настройка нагревательную лампу около 40 см от того места, где голова животного будет лежать. Убедитесь, что тепло на уровне полистирола площадки не превышает 40 ° C.
  7. Подготовьте отдельную клетку для оперированных животных.
  8. Готовят определенного количества и объема (максимум 50 мкл) опухолевых клеток в гибкую трубку и хранить ее на льду.

2. Анестезия

  1. Поместите мышь в коробку из плексигласа и начать обезболивающий индукции по высокой изофлюрана потока (5% изофлуран при расходе 10 л / мин).
  2. После прохождения через различные этапы анестезии, удалить мышь из коробки оргстекла только после того, как вошел в стадию предсмертной дыхания, которое может быть легко узнаваемый резким снижением частоты дыхания (<20 об / мин) и глубокими вздохами встряхивания все тело животного.
  3. Быстро поместить животное брюхом вверх на Салфетка стерильная покрыты полистирольной площадку и продолжитьвентиляция на изофлюрана низкопоточной, вставив морду мышки в мундштук для поддержания анестезии. Используйте инспираторную фракцию 1,8-2,2% при расходе около 1 л / мин.
  4. Оцените глубину анестезии во время операции путем вычисления частоту дыхания, которая в идеале от 45 до 60 вдохов в минуту. Адаптировать вдохе изофлуран фракции соответственно, если это не так.
    Примечание: Изменения в вдохе изофлурановым фракции занимают около 60 сек, пока они не вступают в силу. Избегайте проведения кардинальных изменений быстро. Вместо этого необходимо изменить приложение анестетика постепенно.

3. Эксплуатация

  1. Лечить грудь и живот с адекватной дезинфицирующим и менять перчатки после этого.
  2. Подайте вес адаптированный объем карпрофена (5 мг / кг веса тела) в бедро животного.
  3. Осторожно зажать кожи живота с пинцетом, чтобы проверить, если глубина анестезии достаточна.
  4. Выполнить разрез по срединной линии от мечевидного к середине живота с помощью ножниц и щипцов.
  5. Тщательно рассекать пространство вокруг мечевидного выставить его из окружающих тканей.
  6. Место пребывания шов через мечевидного (изнутри наружу) и прикрепить обе нити к держателю выше животных головки с помощью зажима.
  7. Pinch конечности втягивающего вместе и медленно ввести "U" -образные подсказки втягивающего устройства вдоль внутренней брюшной стенки животного.
    Примечание: Эти меры обнажить печень, чтобы облегчить доступ к различным долек. Определение средней и левой боковой доли печени должны теперь быть возможным.
  8. Используйте солевой раствор пропитанной ватный тампон и осторожно надавите медиану мочку вниз. Рассеките вентральной три четверти серповидной связки, которые теперь будут видны между поверхностью Медианная лопасть и диафрагмы.
  9. Теперь используйте два соленых пропитанной ватные тампоны, чтобы сдвинуть медианулопасть и левой боковой лопастью вверх к диафрагме.
  10. Визуализируйте тонкую мембрану между левой боковой доли и хвостатой доли и тщательно проанализируем его.
    Примечание: При выполнении этого протокола на животных из группы А, переходите к пункту 3.18 в этой точке.
  11. Поместите размер 4-0 лигатуры по диагонали вдоль основания левой боковой мочку в.
  12. Затем с помощью ватного тампона, чтобы вернуть левую боковую лопасть в исходное положение.
  13. Аккуратно связать лигатуры как можно ближе к основанию лепестка насколько возможно и оценить для изменения цвета в доле, чтобы проверить адекватно прерванной кровоснабжения.
  14. Резекцию левой боковой лепесток, следуя линии основания лепестка и отметить вес резецировали мочку в.
    Примечание: При выполнении этого протокола на животных из группы В, переходите к пункту 3.18 в этой точке.
  15. Поместите вторую лигатуру между культей левой боковой мочку и базы Медианная лопасть в.
  16. Переставьте Медианная лопасть как шELL и связать лигатуры. Опять же, оценки для изменения цвета в доле, чтобы проверить адекватно прерванной кровоснабжения.
  17. Резекцию медиану мочку и обратите внимание на его вес.
  18. Подключите 1 мл шприц с 30 G иглой и заполнить его с опухолевыми клетками из гибкой трубки, не наклоняя шприц в любое время.
  19. Используйте ватные тампоны для перемещения кишечных петель слева от животного, чтобы разоблачить нижнюю правую мочку.
  20. Вставьте сотовый загруженный шприц в "третьей стороне" устройства на углом 30 ° к вертикали.
  21. Тщательно перемещайте устройство рядом с мышью с иглой чуть выше нижней правой доле.
  22. Медленно шприц в течение третьего устройства вручную, пока кончик ушко не находится в центральной части низшая правой доле в.
  23. Вводят весь объем в центральной части мочки в течение 30-45 сек.
  24. Сжать место инъекции в течение по крайней мере трех минут, пока кровотечение не остановилось.
  25. Снимите пребывания шовный и втягивающим.
  26. Закройте лицевую панель с резорбируемой 5-0 швом с помощью нажатия одной клавиши узлов.
  27. Закройте кожу с 4-0, не рассасывающиеся нити с помощью нажатия одной клавиши узлов.
  28. Начало вентиляции мыши на высокой кислорода потока в течение примерно 1 мин.

4. Послеоперационное процедура

  1. Поместите животное в теплое помещение (около 40 ° С) в течение следующего получаса, чтобы обеспечить адекватное восстановление.
  2. Примешивать питьевую воду животного с 5 мг / мл метамизол в течение 72 ч в послеоперационном периоде.
  3. Проверьте целостность швов тесно в течение по крайней мере трех дней после процедуры.

5. Период наблюдения и Эвтаназия

  1. Мера веса животного ежедневно в течение в общей сложности 14 дней. Оценка их относительно их благосостояния и ограничений соответственно.
  2. Через 14 дней, обезболить животное следующие шаги 2.1 и 2.2 оперативного протокола аго продолжить с протоколом учреждения для эвтаназии животных.
  3. Выполнить средний лапаротомии как описано в шаге 3.4. Для облегчения доступа к брюшной полости, продлить см каудально Разрез 1-1.5. Вставьте втягивающим, как указано в 3.7.
  4. Dissect вдоль остальной части серповидной связки и разрезать нижнюю полую вену так же, как он выходит из краниальном печени.
  5. Отделите печень от диафрагмы, захватывая диафрагму с пинцетом и тупо рассечения в пространство между печени и мышечной ткани.
  6. Поднимите мобилизованы ткани печени от забрюшинного пространства и рассекают его оставшиеся структуры он все еще прикрепленные к: забрюшинной жировой ткани, нижней полой вены и воротной вены.
  7. Проверьте печень после экстракции для любой дополнительной ткани, которая будет ложно способствовать его фактического размера и веса. Извлеченный печени и ее опухоли показаны на рисунке 6.
  8. Рассеките опухоль от инфerior правой доли.
  9. Измерьте размер и вес как опухоли и паренхимы печени.
  10. Сбережение дополнительные образцы ткани из брюшины, лимфатические узлы или другие органы, которые необходимы для анализа ткани

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В нашем конкретном эксперименте, мы включили 30 бестимусных голых-foxn1nu / ню мышей. Они получили срединную лапаротомию, опухолевых клеток инъекции 500000 МС38 опухолевых клеток (растворенных в 50 мкл физиологического раствора), а затем обрабатывали либо 70% резекции печени, 30% резекции печени, или вообще без дальнейшего вмешательства.

Через 14 дней, почти полное восстановление оставшейся печени следующие 30% или 70% резекци...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предыдущие эксперименты, выполняющих операции у грызунов были в состоянии определить некоторые переменные, которые могли бы служить в качестве источников для смещения. Для того чтобы получить надежные и достоверные результаты, рассмотрим следующие меры предосторожности.

Рутинное до операции пост может привести к стеатоз печени 12, который может ингибировать регенерацию печени 13,14. Поэтому не рекомендуется. Самая высокая митотическую активность гепатоцитов изменяется в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Особая благодарность д-ру Бенджамину Motsch за его помощь в технических вопросах. Авторы также хотели бы отметить доктор Маркус Forschner и Бирк Мюллер за их поддержку мультимедиа, Erica Magelky за ее редакционной экспертизы и Лиза Хорнанг, доктор Роланд Jurgons и профессор Стефан фон Хорстен (все от Франца-Penzoldt-Центр, Университет Эрланген) за их профессионализм в обращении и ухода за животными. Мы благодарим профессора Майкла Neumaier в Институте клинической химии, медицинский факультет Мангейм университета Гейдельберг, Германия для обеспечения опухолевых клеток МС38.

Настоящая работа была выполнена в выполнении требований для получения степени "доктор мед." на Friedrich-Alexander-Эрланген-Нюрнбергского университета (FAU).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильно>Оборудование
Работающий микроскопZeissOPMI-1 FC S21
Индукционная клетка (коробка из оргстекла)UNO BV, Нидерланды180000132
Расходомер + Соединительный комплектUNO BV, Нидерланды180000008
Испаритель UNO Sigma DeltaUNO BV, Нидерланды180000002
Ключевой наполнитель для анестетикаUNO BV, Нидерланды180000010
Адсорбер фильтра с активированным углемUNO BV, Нидерланды180000140
Газоотводная установкаUNO BV, Нидерланды180000118
Маска для лица для мышиUNO BV, Нидерланды180000065
Подставка для испарителяUNO BV, Нидерланды180000006
Тепловая лампаPhysitemp InstrumentsHL-1
Пенополистирольная прокладкаRAYHER30074000 
Инструмент для третьих рукTOOLCRAFT ZD-10F
Прецизионные весыKernEW 220-3NM
Весы KernEMB 500-1
Скользящий суппортMIB MIB82026100
Щипцы для микродиссекцииBraun/AesculapBD195R
Ножницы для микродиссекцииBraun/AesculapFD100R
Иглодержатель для микродиссекцииBraun/AesculapBM563R
РетракторFine Science Tools (F.S.T.)No 17001-0Тип: Зажим Bowmann
Braun/AesculapBJ002R
Название<strong>CompanyНомер в каталогеКомментарии
Расходные материалы
(ПРИМЕЧАНИЕ: Количество указано для каждого животного и процедуры)
Стерильная чехол Foliodrape (45 см x 75 см)Hartmann
(2 шт)Стерильная жидкость Hartmann4700151Peha
(0,9% NaCl)Braun3570310PZN=04454809
(Softasept - 250 мл)Braun3887138PZN=0762008808505018
2 шприца по 1 мл (Injekt-F)Braun9166017V
26 г канюли (Стерикан) - для инъекций карпрофенаBraun4665457
30 г канюли (Стерикан)  - для инъекций опухолиBraun4656300
Капрофен (=Римадил)PfizerQM01AE91
Метамизол (= Новаминсульфон)Ratiopharm16543.00.00
4-0 Викрил шовный материалEthiconJ835G
5-0 Проленовый шовный материалEthicon8618G
SafeLock Flex-Tube 1,5 млEppendorf 
4 x 4 марлевая губкаKendall/Covidien БЗК: 728795135355 ASIN: B005BFQTWM 
Большая скрепкаACCOA7072510G
NameCompanyКаталожный номер>Комментарии
Animals
Female athymic nude-foxn1nu/nuHarlan Laboratories B.V.Код 069
Стерильные ватные палочки 2775001 Дезинфицирующее средство 22363778

Ссылки

  1. Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
  2. Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
  3. Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
  4. Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
  5. Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
  6. Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
  7. Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
  8. Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
  9. Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
  10. Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
  11. Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
  12. Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
  13. Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
  14. Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
  15. Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
  16. Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
  17. Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
  18. Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
  19. Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
  20. Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
  21. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
  22. Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
  23. Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
  24. Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
  25. Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
  26. Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Регенерация печенимодель на мышахиммуногистохимияпролиферация опухолиобъем опухоливес опухолигипертрофия печенипослеоперационное наблюдение
Влияние печени засечки на внутрипеченочных опухолевого роста
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.