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방법 논문

의 방사 법적 측정 [

8.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/53947

⸱

2016년 7월 18일

 ,  , 
1Department of Psychology, Fo Guang University, 2Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

설치류 모델에서 [14C]-요오도안티피린(IAP) 흡수를 측정하고 중추 뇌졸중 후 통증(CPSP)에 관여하는 신경 기질의 활성화를 평가하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

뇌졸중 환자의 약 8%가 중추성 뇌졸중 후 통증(CPSP) 증상을 보입니다. CPSP는 통각 자극에 대한 이질통 및 과민성과 관련이 있습니다. 일부 연구에서는 신경병성 통증이 배외측 전전두엽 피질, 상측 전방 대상피질, 편도체, 해마, 회상주위 회색, 상측 복내측 수질 및 내측 시상과 관련이 있을 수 있음을 보여주었지만, CPSP를 매개하는 신경 기질과 그 연결은 불분명합니다. [14C]-요오도안티피린(IAP) 흡수를 측정하여 자발적으로 활동적인 통증을 평가할 수 있습니다. 동물 모델에서 CPSP에 관여할 수 있는 신경 기질의 활성화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 쥐를 대상으로 한 [14C]-IAP 방법은 다른 뇌 매핑 기술에 비해 수행 비용이 저렴합니다. 본 [14C]-IAP 프로토콜은 설치류 모델에서 시상의 복부 기저핵(VB)의 병변에 의해 유도되는 CPSP에 관여하는 신경 기질의 활성화를 측정하는 데 사용됩니다.

서론

스트로크 출혈이 신경 병증 성 통증으로 고통 환자의 8 % 이상에서 발생하는 것으로 나타났다과 같은 중앙 뇌졸중 후 통증 (CPSP)라고합니다. 1-3 CPSP가 체 감각 장애, 이에 과민과 이질통을 유도 발생할 수 있습니다. (4) 그러나 , CPSP의 체성 감각 기능 장애의 병태 생리 학적 메커니즘은 불확실 남아있다. 예를 들어, 체성 감각의 손실은 출혈성 뇌 영역에서 신경 deafferentation 기인. 통각 과민은 중앙 통각 신경 세포 또는 중앙 탈 억제, 5, 6하지만 CPSP 증상에 관여하는 신경 기판을 알 수없는 남아의 hyperexcitability에 의해 발생할 수 있습니다. 일부 연구에서는 전전두엽 피질 (dPFC), 주동이의 앞쪽에 cingulate 피질 (ACC), 편도체, 해마, periaqueductal 그레이 (PAG), 주동이의 ventromedial 수질, 서로와의 연결이 침해 처리를 중재 할 것을 제안했다. 추가 7LY, 내측 전두엽 피질 (mPFC) -amygdala 회로는 CPSP의 병태 생리 학적 메커니즘에 8 데이터가 다양하다. 통증 관련 인식에 관여하는 것으로 도시 및 CPSP에 신경 기판의 활성화는 더 조사가 필요했다.

[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) 흡수는 뇌 활동 CBF의 관계를 가정하여, 간접적으로 지방 뇌 혈류 (rCBF)을 관찰하는 데 사용된다. 비록 [14 C] -IAP 이러한 기능 자기 공명 영상 (fMRI)와 같이, 실시간으로 뇌 활동을 평가할 수 없으며, 이는 여러 가지 장점을 갖는다. 예를 들어, [14 C] -IAP는 자발적으로 측정 병적 인 상태 동안 뇌 이벤트를 발생하기에 적합하다. (9) 또한, [14 C] -IAP 흡수가 마취없이 측정한다. 또한, 자기 공명과 양전자 방출 단층 촬영 (PET)를 포함하는 다른 이미징 방법보다 적은 비용이 든다. 에서 [14 C] -IAP 방법은 measurin에 적합한 것으로 제안되었다시상의 복부 기저 핵 (VB)의 병변에 의해 유도되는 g 자발 통증 (예를 들어, CPSP). (9)

본 프로토콜은 동물 모델에서 시상의 VB의 병변에 의해 유도되는 CPSP의 신경 기판의 참여를 평가하는 [14 C] -IAP 방법을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 행동과의 연결 수준 CPSP 증상을 기초 병리 생리 학적 메카니즘을 결정하는 방법을 제공한다.

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프로토콜

본 연구의 프로토콜은 대만의 중앙 연구원 기관 동물 관리의 승인 및 이용위원회를 받았다.

1. 동물 준비

  1. (- 400g 약 300) 수컷 흰쥐를 가져옵니다. 음식과 물을 무료로 이용할 수로 (오전 8:00에 불이) 12 시간 / 12 시간 빛 / 어둠 사이클에서 - (22 °의 C, 습도 50 % 21) 에어컨 방에 ​​쥐를 유지한다.

2. 실험 절차

  1. 쥐의 모든 실험 전에 1 주간 자신의 홈 케이지의 환경에 적응하도록 허용합니다. 적응하는 동안, 기준을 설정하는 데 프레이와 발바닥 테스트를 수행합니다.
  2. 프레이 테스트
    1. 거주 30 분 동안 아크릴 케이스 (30 cm × 30 cm × 80 cm)에 쥐를 놓습니다.
    2. (. 아니 필라멘트 11-20) 본 프레이 필라멘트를 구하는 동일한 길이를 가지고 있지만, 직경이 변화하는 범위를 제공하도록100g - 2의 힘.
    3. 쥐의 뒷발의 발 움츠림 역치를 평가 5 분 intertrial 간격 아크릴 판에 그물 형 포트를 통해 hindpaws의 중심을 자극 프레이 필라멘트를 사용한다. 최대인가 된 압력이 기록 될 때까지 로우에서 하이로 오름차순으로 필라멘트를 사용하여, 최대인가 된 압력을 기록한다. (10)
    4. 쥐 자극에 대한 발 움츠림 반응을 나타낼 때, 필라멘트 수를 기록한다. 가장 낮은 자극에 따라이 재판에서 철수 응답을 확인합니다.
    5. 동일한 래트에 연속 3 회, 총 즉시 동일한 절차를 반복한다. (g)에 대응하는 힘에 필라멘트 번호를 변환하고 값을 평균.
  3. 발바닥 테스트
    1. 거주 30 분 (4 개의 프레임 80 cm × 30 cm × 15 센티미터로 구분) 투명한 플렉시 글라스 상자에 쥐를 놓습니다.
    2. INF를 사용하여rared 광선은 유리판을 통해 뒷발의 중심을 자극한다. 약 10 초의 평균 발 움츠림 응답 대기 시간을 얻기 위해 적외선 강도를 조정한다. 적외선 광원을 켜고 디지털 솔리드 스테이트 타이머를 시작하는 키를 누름으로써 시험을 실시한다. 적외선 광선의 지속 시간을 조작 할 수 있습니다.
    3. 래트가 발 움츠림 반응을 나타낼 때에 ​​외광의 지속 시간을 기록한다. 최장 기간은 조직의 손상을 방지하기 위해 각 시험에서 20 초를 초과 할 수 없습니다. 연속적인 자극을 피하기 위해 적어도 5 분의 intertrial 간격을 사용합니다.
    4. 좌우 hindpaws 세 실험 테스트를 반복하고, 각 래트 뒷발에 대한 각각의 평균을 계산한다.
  4. 콜라게나 병변 수술
    1. 수술 자극이 발생에 발가락 - 핀치 응답의 손실과 체세포 응답 할 때까지 4 % 이소 플루 란과 쥐를 마취. 2 % isoflur - 1.5 마취 유지수술 시간 동안 메탄.
    2. 37.5 °의 C - 36.5에서 체온을 유지하기 위해 간단한 가열 패드와 정위 장치에서 쥐를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 아이 크림을 적용합니다.
    3. 멸균 전기 면도기로 털을 면도하고 두피의 정중선을 따라 메스와 부드러운 절개 (약 2-2.5 cm)를 확인합니다. 섭리의 요오드 및 소독 75 % 알코올 용액을 교대로 피부와 두개골을 청소합니다. 수술 단계 동안 모든 기기, 도구 살균 75 %의 알코올을 사용하고, 작업대는 무균 상태를 유지하기. 그 전에, 모든 수술 재료는 증기 오토 클레이브 멸균해야합니다.
    4. (시상의 (복부 후 내측 시상 핵 [VPM]와 복부 외측 시상 핵 [VPL] 포함) VB를 통해 전기 드릴로 두개골에 3.0 작은 구멍 (3 mm 직경)를 멸균 장갑과 악기를 사용하여 드릴 -3.5 mm 후방, 3.0-3.5 mm 측면) 정수리, 두개골 표면 5.5-5.8 mm 깊이합니다.
    5. Microinject 생리 식염수 0.5 μL 또는 각각 제어 및 실험 그룹에서 4 형 콜라겐 용액 0.125 U.
    6. 약물의 확산을 허용하도록 추가로 5 분 동안 곳에 주사 바늘을 유지.
    7. 두개골에 구멍을 채우기 위해 치과 시멘트를 사용하고 절개를 봉합. 봉합 절개 후 상처 로컬 진통 마취제 (리도카인 연고)를 적용하고, 자신의 홈 케이지로 돌아갑니다.
    8. 수술 후 단독으로 그들은 흉골 드러 누움을 유지할 때까지 플라스틱 케이지의 쥐를 수용하고, 마취에서 회복 될 때까지 따뜻하게 유지합니다.
  5. 수술 회복 후 행동 테스트
    1. 수술에서 회복 7 일 후, 섹션 테스트 단계 2.2과 2.3의 절차를 반복합니다. 건강과 동물의 발달 상태를 모니터링하면서 사주를 통해 행동 테스트를 수행합니다.
    2. 이후 수술 단계의 제어 및 실험군의 동물의 건강 상태 (예를 들어, 체중, 먹이 양, 그리고 자유로운 움직임)을 모니터한다.
  6. PE-50 튜브와 함께 정맥 주입을 수행
    1. 4 % 이소 플루 란 마취 래트 및 36.5에서 체온을 유지 - 단순한 가열 패드와 37.5 ° C.
    2. 메스로 각각 왼쪽 어깨와 흉강의 복부 부분의 지느러미 앞발의 일부 교차로의 중간 선에 두 개의 구멍 (2cm 직경 각)을 잘라.
    3. 두 구멍 사이 가위로 피부와 근육을 떼어 놓다.
    4. 복부 구멍을 통해 외부 경정맥에 PE-50 튜브 (20cm 길이)의 한쪽 끝을 연결합니다. 지느러미 구멍 같은 PE-50 튜브의 말단을 연결하고, 피부에 부착합니다.
    5. 확인하기 위해 경정맥에 식염수를 주입하는 주사기를 사용하여 그 PE-50 튜브방해하지 않습니다.
    6. 절개 부위를 봉합하고, 6 ㎎ / ㎏ 겐타 마이신 (복강 내)로 쥐를 주입.
    7. 20 U / ㎖ 헤파린과 생리 식염수 0.1 ml의 다음에, 0.3 ml의 0.9 %의 식염수로 튜브를 수술 후 매일을 플래시합니다.
  7. 최종 행동 테스트
    1. 반복이 그 동작을 확인 2.2-2.3 단계 단계 2.6 이후 1 주일 수술 복구 후 단계 2.5에 비해 안정적이다.
  8. 추적자 주입
    1. 적응을위한 10 분 - 5 휴식 케이지에 쥐를 놓습니다.
    2. 스플리터를 사용하여, 두 1ml를 주사기에 PE-50 튜브를 연결합니다. 생리 식염수 하나의 주사기를 입력하고 (- 0.5 ml의 0.3의 볼륨에 125 μCi를 / kg) [14 C] -IAP 솔루션을 다른 입력합니다.
    3. 외부 경정맥에 추적자를 주입하고, 3 M 염화칼륨 가득 다른 주사기 주사기를 교체합니다.
    4. 텐 초 추적자의 INJ 후ection, 표준 안락사 방법에 따라 동물을 이소 플루 란의 과다 복용에서 3 M 염화칼륨을 주입하고, 희생 (즉, 50 분 동안 기화기에서 이소 플루 란) 대만하여 중앙 연구원 기관 동물 관리의 지침과 이용위원회를 기반으로.
    5. 1 분 후, 두개골을 노출하고, 나머지 근육 잘라내. rongeurs를 사용하여 뇌에서 두개골의 지느러미 표면을 벗겨. rongeurs을 이용하여 두개골의 측면을 얻어 낸다. 다음에, 주걱을 이용하여, 뇌의 복부 표면을 따라 후각 신경 전구 연결을 잘라 뇌를 제거한다.
    6. 드라이 아이스와 메틸 부탄의 두뇌를 동결 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물을 사용하여 (약 -55 ° C). 냉동실에 뇌 조직을 저장합니다. 11, 12
  9. 뇌 슬라이스
    1. 후뇌이 아래를 향하도록하여, 마이크로톰에서 조직의 방향. 20로 뇌를 슬라이스 그라 이오 스탯을 사용하여# 181; m 두께의 섹션.
    2. 각 조각 사이에 240 μm의 간격으로, -20 ° C에서 저온 유지 장치에 현미경 슬라이드에 뇌 조각을 놓습니다.
    3. 현미경 슬라이드와 -20 ° C에서 3 일간 노출 카세트에 등급 방사능 다섯 표준 필터 종이를 놓습니다. 뇌 조각의 순서에 따라 위에서 아래로 현미경 슬라이드를 준비. 마지막으로, 카세트의 저부에 여과지를 배치했다. 12
    4. 노광 카세트로부터 형광면을 제거하고 뇌 슬라이스 [14 C] -IAP 흡수를 보여주기 위해 이미지를 형광체 스크린을 읽고 생성하는 가변 모드 이미 저를 사용한다.

3. 데이터 분석

  1. 단계 2.9.4 후에 통계적 매개 변수 사상 (SPM) 및 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 이미지를 조정한다. 직렬 관상 섹션을 사용하여 모든 이미지를 재구성. 부드럽고 기준 쥐 뇌 모델에 따라 이미지를 정규화.12 13
  2. 정량적 평가를 위해, 픽셀 신호 강도를 판정하고, 통계 해석 소프트웨어를 사용 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 관심 영역 뇌 영상 (ROI)을 측정한다. (12, 13)
  3. 다른 뇌 핵 사이의 연결을 조사하기 위해, 지역간 상관 행렬의 방사능 비율을 표시하는 MATLAB 상관 분석 소프트웨어를 사용하여 컬러 맵 행렬로 시각화. 마지막으로, 네트워크 분석 Pajek 소프트웨어를 사용한다. (12) (13)
  4. 베이스 라인에서 가짜 및 CPSP 그룹의 프레이 시험에서 발바닥 시험 및 기계적 힘에 열 관용의 지속 기간을 비교, 2 × 편차의 5 양방향 혼합 분석 (ANOVA), 그룹 및 주 요인으로 사용하고 주 1 - 5. ANOVA 그룹 뇌 영역에있어서 방사능 비율을 측정하는 2 × 31 양방향. 적절한 경우, Tukey에의 정직 유의 한 차이 (HSD) 사후 검사를 실시하고 있습니다. 칼culate 피어슨 상관 관계는 가짜와 CPSP 그룹에서 선택된 뇌 영역의 모든 사이에 상관 관계를 평가하는 계수.

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결과

도 1a는 실험적인 타임 라인을 도시한다. 쥐가 행동 검사에 대한 사기 및 CPSP 그룹 (즉, 본 프레이 시험 및 발바닥 시험)에 할당되었다. 실험의 첫 날 기준으로 제공하고, 시험 1 주에 반복 - 4 헤파린 (20 U / ㎖, 0.1 ㎖ / 일) 동안 주입 일주일에 5 P​​E-50 카테터 외부 경정맥을 시행 하였다 주 (4)과 헤파린 주사 후 5. 5 분, [14 C] -IAP가 주입, 희생 마취제의 과다 복용으로 10 초 이상 따랐다. 한 분 후, 래트를 참수시키고, 옥트 매립 뇌 조각이 만들어졌다.도 1b는 외과 정위 장치 정맥 주입 사이트, 래트 뇌 아틀라스에 기초하여 상기 뇌 조각 학적 맵에 쥐를 나타낸다.도 1c 방송 도표 빨간색 외부 경정맥의 오른쪽 구멍은 PE-50 튜브의 위치,최종 실험 장치....

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토론

행동 검사에서 CPSP 그룹 기준의 본 프레이 시험 열 통증 검사 기계적 힘의 발 움츠림 역치의 감소 및 일주 전시 -. 5. 결과는 이전의 연구와 일치 하였다 14

에서 [14 C] -IAP있어서 다른 뇌 조각의 정량적 분석을 위해 뇌 영상의 화소 강도에 의존한다. 뇌 영상의 데이터를 평가하기 위해, 픽셀 신호 강도를 정의 하였다. 46.​​979 CPM - 본 연구에서, 환경 배경 신호는 25.811로 정의 하였다. 에서 [14 C] -IAP 0.001 μCi를 여과지의 신호는 CPM (42)로 정의 하였다. 픽셀 신호 강도는 백그라운드 강도로서 <μCi를 0.001이었다. 다섯 여과지의 화소 강도 뇌 영상의 각 화소의 계조로서, 0.001, 0.01, 0.1 및 10 μCi를 결정 하였다. [14 C]는 -IAP 방사능은 AP 통신을 보였다픽셀 강도 및 방사능와 ositive 상관 관계 ...

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공개 사항

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

본 연구는 박사 바이 - 추앙 Shyu (NSC 99-2320-B-001-016-MY3, NSC 100-2311-B-001-003-MY3 및 NSC 102-2320-에 국가 과학위원회의 보조금 지원 B-001-026-MY3). 이 작품은 중앙 연구원에서 자금을받은 생명 과학 연구소에서 실시 하였다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마취제:
IsofluraneHalocarbon Products Corporation NDC 12164-002-254%
Surgery
homeothermic blanket systemHarvard ApparatusModel 50– 7079체온은 36.5 - 37.5°C로 유지되었습니다.
10 & 마이크로; l 마이크로 주사기Hamilton80008, 모델 1701SN콜라겐 분해 효소
폴리에틸렌 -50 튜브Becton, Dickinson and Company427411외부 경정맥
1 cc 주사기Terumo Medical ProductsSS-01T14< / sup>C-IAP 및 식염수로 주입.
식염수 (염화나트륨 0.9 gm)Taiwan Biotech Co., LTD.100-130-0201튜브를 플러시하려면
<강력한>약물
형 4 콜라겐분해효소SigmaC5138-500MG0.125 U
겐타마이신SigmaG1264-250MG6 mg/kg
헤파린시그마H939920 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP)PerkinElmerNEC712125 mCi/kg 300 ml 0.9% 식염수
염화칼Merck1.04936.10003 M
Behavior system:
von Frey esthesiometerFabrication Enterprises, Inc.Baseline Tactile Monofilaments 12-1666기계적 통각과민은 기계적 자극에 대한 금단 반응을 측정하여 평가되었습니다
발바닥 검사 장치IITC Life ScienceIITC 390G Plantar Test열 통각과민은 복사열에 대한 반응으로 뒷발 철수 잠복기를 측정하여 평가되었습니다.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compoundSakura Fintek Inc4583은
뇌 드라이 아이스를(대략 &마이너스; 55 > C)
메틸부탄SigmaM32631-1L은 드라이 아이스/메틸부탄에 얼어있습니다(대략 &마이너스; 55 > C)
크라이오스타트  Leica Biosystems Nussloch GmbH, 독일Leica CM1850코로나 뇌 절편이 이 기계에서 절편화되었습니다.
<강>데이터 분석
노출 카세트 형광체 스크린Amersham Biosciences 20cm x 25cm슬라이스를 유리 슬라이드에서 건조시키고 등급이 매겨진 방사능이 있는 5개의 표준 여과지와 나란히 놓았습니다. 모든 슬라이드는 &마이너스에서 카세트에 노출되었습니다. 20 °C.
&감마;-카운터Beckman CoulterBeckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter여과지의 방사능 계수를 측정합니다.
Typhoon 9410 가변 모드 이미저  주식회사 지엠아이WS-S9410의해 노출된 형광체 스크린을 읽으려면
Wellcome Centre for Neuroimaging버전 8모든 뇌의 평균을 구하여 최종 뇌 템플릿을 만들었습니다. 이 두 그룹의 이미지 간에 유의미한 차이를 확인하기 위해 이미지는 CPSP 그룹에서 가짜 그룹을 빼서 파생되었습니다.
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij버전 1.46인접 섹션은 수동으로 정렬하거나 ImageJ 소프트웨어의 자동화된 픽셀 기반 등록 알고리즘인 Stack-Reg를 사용하여 정렬되었습니다. 원래의 3차원으로 재구성된 모든 뇌는 참조 쥐 뇌 모델로 평활화되고 정규화되었습니다.
MatlabMathWorks버전 2009b는 Pearson 상관 계수를 사용하여 CPSP와 가짜 그룹 간의 관계를 조사했습니다. 지역 간 상관 행렬은 각 그룹의 동물에 대해 계산되었습니다.
Pajekhttp://Pajek.imfm.si/버전 3.06그래픽 이론 분석은 Pajek 소프트웨어를 사용하여 위의 상관 행렬에 의해 정의된 네트워크에서 수행되었습니다.
륨 드라이 아이스/메틸부탄에 얼린 내장했습니다 뇌 슬라이스 SPM(Statistical Parametric Mapping)에 에서

참고문헌

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  4. Greenspan, J. D., Ohara, S., Sarlani, E., Lenz, F. A. Allodynia in patients with post-stroke central pain (CPSP) studied by statistical quantitative sensory testing within individuals. Pain. 109 (3), 357-366 (2004).
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  11. Jay, T. M., Luciqnani, G., Crane, A. M., Jehle, J., Sokoloff, L. Measurement of local cerebral blood flow with [14C]iodoantipyrine in the mouse. J Cereb Blood Flow Metab. 8 (1), 121-129 (1988).
  12. Lu, H. C., Chang, W. J., Kuan, Y. H., Huang, A. C., Shyu, B. C. A [14C]iodoantipyrine study of inter-regional correlations of neural substrates following central post-stroke pain in rats. Mol Pain. 11 (1), (2015).
  13. Wang, Z., et al. Functional brain activation during retrieval of visceral pain-conditioned passive avoidance in the rat. Pain. 152, 2746-2756 (2011).
  14. Wasserman, J. K., Koeberle, P. D. Development and characterization of a hemorrhagic rat model of central post-stroke pain. Neuroscience. 161 (1), 173-183 (2009).

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