Por primera vez presentamos aquí un procedimiento de bandas reproducible para alterar la hemodinámica en el corazón en desarrollo ex ovo. Esto se logra constriñiendo parcialmente el tracto de salida (OFT).
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En este artículo
Resumen
Resumen
El nuevo modelo presentado aquí se puede utilizar para comprender la influencia de la hemodinámica en procesos específicos del desarrollo cardíaco, a nivel celular y molecular. Para alterar la hemodinámica intracardíaca, los huevos de gallina fecundados se incuban en una cámara humidificada para obtener embriones del estadio deseado (HH17). Una vez alcanzada esta etapa de desarrollo, el embrión se mantiene ex ovo y se altera la hemodinámica en el corazón embrionario mediante la constricción parcial del tracto de salida (OFT) con una sutura quirúrgica en la unión del OFT y el ventrículo (OVJ). Los embriones de control también se cultivan ex ovo, pero no se someten a la intervención quirúrgica. A continuación, los embriones con bandas y de control se incuban en una incubadora humidificada durante el período de tiempo deseado, tras lo cual se emplea la ecografía 2D para analizar el cambio en la velocidad del flujo sanguíneo en la OVJ como resultado de las bandas OFT. Una vez que los embriones se mantienen ex ovo, es importante asegurar una hidratación adecuada en la cámara de incubación para evitar la desecación y, finalmente, la muerte del embrión. Con este nuevo modelo de bandas, ahora es posible realizar análisis de cambios en la expresión de actores clave involucrados en el desarrollo de válvulas y comprender el papel de la hemodinámica en las respuestas celulares in vivo, lo que no se podía lograr anteriormente.
Introducción
Las válvulas de salida anormalmente formadas son el tipo más común de defectos cardíacos congénitos 1. Sin embargo, la estructura y función defectuosa de la válvula cardíaca, aunque esté presente desde el nacimiento, puede volverse sintomática solo en la edad adulta. De hecho, varias enfermedades valvulares del adulto pueden atribuirse a un origen congénito. El tratamiento de estos pacientes a menudo implica el reemplazo de válvulas defectuosas y, lo que es más importante, se ha demostrado que las válvulas aórticas reemplazadas tienen anomalías congénitas 2. Dado el hecho de que los procesos críticos involucrados en el desarrollo de la válvula comienzan temprano durante la embriogénesis, se destaca la importancia de comprender mejor los mecanismos que regulan estos eventos.
El tubo cardíaco primitivo, que es el primer órgano funcional en un embrión, exhibe dos capas distintas: un endocardio endotelial rodeado de miocardio, separado por una matriz extracelular (gelatina cardíaca) que es producida y secretada principalmente por el miocardio 3-5. A medida que el desarrollo continúa, se forman los primordios valvulares (almohadillas endocárdicas), después del bucle hacia la derecha del corazón embrionario, por expansión local de la gelatina cardíaca en el canal auriculoventricular (AV) y el tracto de salida (FOT) 4,6. Esta expansión está mediada por el proceso altamente regulado de transición epitelio-mesenquimal (EMT), durante el cual la gelatina cardíaca se pobla, por células mesenquimales derivadas endocárdicamente 6. Además de la población mesenquimal derivada a través de EMT, las células de la cresta neural también están involucradas en la valvulogénesis de la OFT 3.
< clase p='jove_content'>Los estímulos hemodinámicos, como el estrés cortante, son factores epigenéticos importantes que regulan el desarrollo del corazón en el embrión 7,8. Utilizando un sistema in vitro 3D, hemos demostrado previamente que el estrés de cizallamiento es un factor que influye en la expresión y deposición de proteínas fibrosas de la matriz extracelular (MEC) en cojines AV y OFT 9,10. Además, los estudios realizados por varios investigadores han demostrado que la alteración del flujo sanguíneo conduce a válvulas inadecuadas y a la formación de septos 11-16. Recientemente, utilizando el novedoso procedimiento de bandas presentado aquí, hemos demostrado que el cambio de la hemodinámica en el corazón de un pollito embrionario afecta a los procesos tempranos implicados en la formación de la válvula OFT 17.La técnica descrita aquí proporciona un modelo novedoso para alterar la hemodinámica en el corazón de un pollito en desarrollo mediante la constricción parcial de la OFT ex ovo. Este procedimiento reproducible es relativamente rápido y permite a los investigadores obtener un número suficiente de embriones, corazones enteros, tejido OFT, etc., para los análisis posteriores, incluidos los estudios de expresión génica. Además, este nuevo modelo se puede utilizar para estudiar los efectos "crónicos" de la hemodinámica alterada en el desarrollo de la válvula OFT.
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Protocolo
embriones de aves no se consideran animales vertebrados bajo las regulaciones IUCAC.
1. La obtención de embriones para la cirugía
- Incubar 80 - 90 huevos de gallina fertilizados Bovan (romo) terminan en un humidificado (60%) del eje de balancín incubadora a 40 ° C durante aproximadamente 72 h para obtener embriones a Hamilton y Hamburger (HH) etapa 17. Determinar el número exacto de los huevos sobre la base de el análisis del poder y la tasa de supervivencia de los embriones 17. Use bandejas de huevos de plástico para la incubación para permitir la circulación de aire adecuada.
- Una vez que se alcanza esta etapa de desarrollo deseada, vierta aproximadamente 20 ml de (37 ° C) de tampón caliente de Tyrode (suplementado con bicarbonato de sodio (1 g / L)) en un 100 mm x 26 mm placa de Petri.
- Esterilizar una cáscara de huevo con un 70% de etanol.
- Suavemente romper la cáscara con un mango de bisturí y liberar cuidadosamente su contenido en el plato que contiene tampón de Tyrode. Desechar los embriones si (i) que aparecen visualmente anormal (ii)No están en fase de desarrollo a la derecha (iii) que están orientadas incorrectamente sobre la yema y / o (iv) se produce cualquier sangrado. Retener cualquier embriones no sometidos a cirugía inmediatamente después de ser colocado ex ovo a 40 ° C con el fin de no comprometer el desarrollo.
Nota: La estadificación se realiza en base a Hamilton y Hamburger 18. Anormalidad de embriones de pollo se determina por el ojo desnudo y en el ámbito de la disección. Asegúrese de que el embrión tiene plegamiento apropiado y flexión y la vasculatura.
2. OFT Bandas
- Con pinzas individuales hilos de 1 cm de largo de una sola sutura quirúrgica 11/0 de nylon y formar un nudo flojo. UV esterilizar todos los nudos preformados.
- Bajo un microscopio de disección, asegurar visualmente que el corazón late a un ritmo normal (~ 120 latidos / min). Si no es así, desechar el embrión.
- Justo antes de la cirugía, aplique 5 - 6 ml de (C 37 °) tampón de Tyrode caliente a la superficie del embrión utilizando una pipeta de transferencia.
- Pase un extremo libre del nudo preformado bajo la OFT, la posición de la sutura en el OFT / unión ventrículo (OVJ) (o la ubicación deseada), y pasar el extremo libre en el nudo de la constricción de este modo la OFT incluyendo las membranas que rodean el corazón.
- Después de la cirugía, mojar la superficie de la yema con 5 - 6 ml de tibia (37 ° C) tampón de Tyrode utilizando una pipeta de transferencia.
- Mantener el control de embriones ex ovo ya que los embriones en bandas; Sin embargo no someterlas al procedimiento quirúrgico.
- Incubar los embriones, por la cantidad deseada de tiempo, a 40 ° C en un incubador humidificado (60%).
- Una vez que se alcanza el punto de tiempo deseado, escindir el embrión a partir de la yema de huevo con unas tijeras rectas. Diseccionar el corazón con unas pinzas finas y el uso de varios estudios posteriores, tales como cambios en la morfología cardiaca debido a la alteración hemodinámica 17.
3. Confirmación de que la intervención de las bandas provoca un cambio en Hemodinámica
Nota: La constricción parcial causada por la intervención de bandas conduce a un aumento de la velocidad del flujo sanguíneo en el OVJ. Este parámetro hemodinámico se evalúa convenientemente usando imágenes por ultrasonido 2D, que se realiza en el punto de tiempo deseado del experimento.
- Dado que sólo un único embrión se pueden obtener imágenes a la vez, mantener todos los otros embriones designados para formación de imágenes de ultrasonidos en un 40 ° C incubadora.
- Coloque la placa de Petri que contiene el embrión para formar una imagen sobre una almohadilla térmica a 40 ° C.
- Llenar el recipiente, hasta el borde, con tampón caliente (37 ° C) de Tyrode. Verter lentamente la solución tampón en el plato con el fin de mantener intacta la yema. Si, sin embargo, la integridad de la yema se ve comprometida durante este paso, desechar el embrión.
- Orient el embrión de manera que el eje central del embrión es perpendicular a la sonda de ultrasonido que está suspendido de un soporte ajustable.
- Con la ópera máquina de ultrasonidoting en modo B, la obtención de una imagen 2D del corazón que late en la pantalla y mover la etapa (almohadilla térmica) de tal manera que la OFT, ventrículo y OVJ son claramente visibles.
- Cambiar al modo de onda pulsada (PW), en la frecuencia de repetición de impulsos deseada (por ejemplo, 20 kHz) y obtener datos de velocidad exactamente en el OVJ. Una imagen en modo B de los latidos del corazón se obtiene en la pantalla.
- Mover el escenario para ver la OFT, ventrículo y la OVJ. Usando el software de la máquina de ultrasonido, obtener mediciones de la velocidad exactamente en el OVJ.
Nota: Si la frecuencia cardíaca de un embrión disminuye durante la proyección de imagen, datos de velocidad así obtenidos no deben ser utilizados para el análisis. Todos los embriones utilizados para mediciones de velocidad no deberían preferentemente ser utilizados para ningún otro experimentos después de la ecografía.
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Resultados
Se muestra en la Figura 1 son instrumentos necesarios para bandas OFT recomendado. La placa de Petri (Figura 1A) que contiene el embrión ex ovo debe ser lo suficientemente profunda como para no destruir el embrión cuando se cubre con la tapa. Placas de petri profundas (Figura 1C) también deberían utilizarse para obtener imágenes de ultrasonido para permitir un volumen adecuado de tampón de Tyrode que se vierte encima de la yema....
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Discusión
Esta técnica es relativamente rápida y fácil de realizar, sin embargo ciertos puntos clave deben ser tenidos en cuenta a fin de obtener resultados precisos aguas abajo. Los embriones deben mantenerse ex ovo en una placa de Petri que contiene tampón de Tyrode para proporcionar una adecuada rehidratación. También es importante para hidratar la yema después de la cirugía con tampón de Tyrode y para asegurarse de que la cámara de incubación se hidrata adecuadamente. Las cirugías no deben realizarse en un embrión si...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Dr. Robert Price y al personal del Centro de Recursos de Instrumentación de la Facultad de Medicina de la Universidad de Carolina del Sur. Este trabajo fue parcialmente apoyado por una beca de investigación de posgrado SPARC de la Oficina del Vicerrector de Investigación de la Universidad de Carolina del Sur (JDP / VM). Además, este trabajo fue apoyado por el acuerdo de investigación de Cook Biotech (JDP) y por FirstString Research Inc (JDP) y NIH 2 P20-RR016434-06 (JDP). Además, la subvención de las Redes de Excelencia en Investigación Biomédica (INBRE) de los NIH IDeA para la P20GM103499 de Carolina del Sur (JE)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Huevos de gallina Bovan fertilizados | Clemson University, Clemson, SC | ||
| 11 / 0 Sutura de nailon | Ashaway | S30001 | UV esterilizar nudos antes de la cirugía |
| 100 x 26 mm placa de Petri | VWR | 25387-030 | |
| Pipetas de transferencia | Thermo Scientific | 232-20S | |
| Mango de bisturí #3 | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Tijera recta | Roboz | RS-6702 | |
| Dumont #5 pinzas finas Fine | Science Tools | 11254-20 | |
| Tampón Tyrodes | Sigma-Aldrich | 2145-10L | Esterilizar el filtro antes de usar |
| Bicarbonato de sodio | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Vevo 770 Sistema de imágenes de ultrasonido | VisualSonics, Inc. | VS-11392 | |
| 708 Transductor de ultrasonido | VisualSonics, Inc. | VS-11171 |
Referencias
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