קולגן הוא רכיב ליבה של ECM, ומספק רמזים חיוניים מספר תהליכים תאיים החל הגירת בידול ושגשוגם. הניתן כאן הוא פרוטוקול להטבעת תאים בתוך הידרוג קולגן 3D, טכניקה מתקדמת יותר ליצירת מטריצות קולגן אקראי או מיושר באמצעות microchannels PDMS.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הכנת ג'לי 3D קולגן microchannels לחקר אינטראקציות 3D
במאמר זה
סיכום
תקציר
מבחינה היסטורית, רוב התהליכים התאיים נחקרו בשני ממדים בלבד. בעוד שמחקרים אלה היו אינפורמטיביים לגבי מנגנוני איתות תאים כלליים, הם מזניחים רמזים תאיים חשובים המתקבלים מהתכונות המבניות והמכניות של המיקרו-סביבה המקומית והמטריצה החוץ-תאית (ECM). כדי להבין כיצד תאים מתקשרים בתוך ECM פיזיולוגי, חשוב לחקור אותם בהקשר של מבחנים תלת מימדיים. נדידת תאים, התמיינות תאים והתפשטות תאים הם רק כמה תהליכים שהוכחו כמושפעים משינויים מקומיים בתכונות המכניות של ECM תלת מימדי. קולגן I, מרכיב סיבי ליבה של ה-ECM, הוא יותר ממרכיב מבני פשוט של רקמה. בתנאים רגילים, רמזים מכניים מרשת הקולגן מכוונים מורפוגנזה ושומרים על מבנים תאיים. במיקרו-סביבות חולות, כגון מיקרו-סביבת הגידול, רשת הקולגן עוברת לעתים קרובות עיצוב מחדש באופן דרמטי, ומדגימה הרכב שונה, תצהיר משופר וארגון סיבים שונה. בסרטן השד, מידת יישור הסיבים חשובה, שכן עלייה בסיבים מיושרים בניצב לגבול הגידול נמצאה בקורלציה לפרוגנוזה גרועה יותר של המטופל1. מטריצות קולגן מיושרות גורמות להפצה מוגברת של תאי גידול באמצעות נדידה מתמשכת2,3. להלן פרוטוקול פשוט להטמעת תאים בתוך הידרוג'ל קולגן סיבי תלת מימדי. פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות לפלטפורמות רבות, ויכול לייצר באופן שחזורי מטריצות קולגן מיושרות ואקראיות לחקירת נדידת תאים, חלוקת תאים ותהליכים תאיים אחרים במיקרו-סביבה פיזיולוגית תלת מימדית מתכווננת.
מבוא
תהליכים תאיים רבים נחקרו בהרחבה בשני ממדים, ובכך יצרו ידע קולקטיבי של מנגנוני איתות תאים בסיסיים. עם זאת, מחקרים אלה מזניחים רמזים תאיים חשובים המתקבלים מהתכונות המבניות והמכניות של המיקרו-סביבה התאית המקומית והמטריצה החוץ-תאית (ECM). כדי להבין טוב יותר כיצד תאים מתקשרים בהקשר פיזיולוגי, חשוב לחקור אותם במבחנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים). ה-ECM עבור מבחנים תלת-ממדיים אלה יכול להיות נגזר מתאים או מורכב מחדש מחלבונים מטוהרים. ללא קשר למקור ה-ECM, מבחני מטריצה תלת מימדיים הוכחו כבעלי ערך רב להבנת האופן שבו תאים מנווטים ומתקשרים בתוך העולם הפיזיולוגי. לדוגמה, תאים הגדלים במטריצות תלת-ממדיות מציגים מצבי תנועה מובהקים התלויים באופי המכני של ה-ECM הסובב אותם, שאינם נצפים בני....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. נטרול, דילול פלמור של פתרונות קולגן לחקירת 3D מבחני התכווצות סלולארית
- על הקרח ברדס רקמה סטרילית תרבות, לנטרל קולגן (1: 1) עם 100 HEPES מ"מ סטרילי, קר כקרח PBS 2x, pH 7.4, צינור חרוטי 15 מ"ל. מערבבים היטב עם פיפטה פלסטיק עד הפתרון הוא הומוגני מערבולות ערבוב אינן גלויות. היזהר לא להכניס בועות אוויר במהלך תהליך הערבוב. אחסן בקצרה על קרח.
- לדלל קולגן מנוטרל לריכוז המתאים עם התקשורת תא (כגון RPMI, DMEM, וכו ').
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעוד מבחני 3D ניתן לעשות זאת בתוך אותה הנוקשות של ג'ל קולגן, שינוי הקשיח ג'ל ניתן להשתמש כדי לקבוע כיצד התאים יגיבו לשינויים מכאניים microenvironment הסלולר שלהם. הידרוג קולגן נוקשה מוגדר כג'ל שבו התאים המוטבעים אינם מסוגלים מקומית להתכווץ קולגן שמסביב. ההתכווצות הפנימית של תאים מסוגים שונים היא ייחודית, ולכן עדיף להתחיל עם עקומת contractility פשוט להקים ריכוז הקולגן כי יהיה המורגש תואם ונוקשה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ג'ל קולגן 3D הם תוספת רבת ערך בארגז הכלים שלנו כדי להבין כיצד תאים לפרש ולהגיב microenvironment המקומית שלהם. כתב יד זה ספק פרוטוקול בסיסי מאוד להטבעת תאים בתוך מטריצת קולגן 3D, וכדי ליצור מטריצות reproducibly עם סיבי קולגן אקראיים או מיושרים. פרוטוקולי שניהם עובדים פלטפורמות וישימות היכן isoforms קולגן השונה, crosslinkers, או חלבונים מטריקס אחרים ניתן להוסיף פוטנציאלי בעת פילמור. זה גם קל לשנות את הפלטפורמות להעריך זמנים ונקודות קצה שונים עבור ביטוי גנים וייצור חלבון. הדמיה, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לחשוף
תודות
המחברים מבקשים להודות UO1CA143069 מספרים מענק, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24, ו T32-GM008692-18 למימון עבודה זו. אנחנו גם מכירים ג'רמי Bredfelt ו Yuming ליו של לוקוסים לפיתוח וסיוע בניתוח CT-FIRE.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| קורנינג | קולגן זנב עכברוש בריכוז גבוה | 354249 | |
| ערכת אלסטומר SylGard184 | קורנינג | NC9285739 | אלסטומר לתעלות PDMS |
| HEPES | Fisher | BP310 | עבור מאגר נטרול HEPES |
| KCl | פישר | BP366 | עבור מאגר נטרול HEPES |
| KH2PO4 | Fisher | BP362 | עבור מאגר נטרול HEPES |
| Na2HPO4 | Fisher | S374 | עבור מאגר נטרול HEPES |
| NaCl | Fisher | BP358 | עבור מאגר נטרול HEPES |
| היטל נויבאואר המציטומטר משופר | פישר | 15170-208 | ספירת תאים 6 בארות |
| צלחת תרבית שאינה רקמה | קורנינג | 351146 | |
| צלחת תחתית זכוכית 50 מ"מ | MatTek | P50g-1.5-30-f | |
| Bel-Art פלסטיק מייבש ואקום Bel-Art | Bel-Art | F4200-2021 | תא הסרת גז |
| לסרט שקיפות PDMS | 3M | pp2950 | סרט פלסטיק למזיגת תעלות pdms |
| ThermoScientific CimaRec | ThermoScientific | HP141925 | פלטה חמה לריפוי מיקרו-ערוצים PDMS |
| ווסת ואקום | דיוק | רפואי PM3100 | ווסת ואקום למיקרו-ערוצי קולגן |
| 8 אינץ' x 8 אינץ' יריעת גומי | אמזון - גומי-קל | סיליקון - | יריעת גומי 60A למזיגת מיקרו-ערוץ PDMS |
| 8 אינץ' x 8 אינץ' x 0.125 אינץ' יריעת אקריליק | יריעות פרספקס | של אמזון | למזיגת מיקרו-ערוצי PDMS |
| משקולות 10 ק"ג | משקולת אמזון | CAP | למזיגת מיקרו-ערוצים PDMS |
| 15 מ"ל צינורות חרוטיים | פישר | 352097 | |
| 50 מ"ל צינורות חרוטיים | פישר | 352098 | |
| צנרת פלסטיק | נקודה מדעית | 229202B, 229206B ו-667225B | 2 מ"ל, 5 מ"ל ו-25 מ"ל |
| 70% EtOH | פישר | NC9663244 |
מקורות
- Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local in....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
