Method Article

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

DOI:

10.3791/54025

⸱

June 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer & Scripps Colleges

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות ניקוי אופטי מחוללות מהפכה באופן שבו רקמות נראות. בדוח זה אנו מתארים שינויים בפרוטוקול המקורי של Clear Lipid-Hybridized Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) שמניב תוצאות עקביות יותר ופחות יקרות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באופן מסורתי, הדמיית רקמות דרשה חתך והדמיה סדרתית של הרקמה המעניינת, מה שחושף כל קטע רקמה לעיוותים לא ליניאריים ייחודיים, מה שפוגע באופן דרמטי ביכולתו של האדם להעריך מורפולוגיה תאית, פיזור וקישוריות במערכת העצבים המרכזית (CNS). עם זאת, טכניקות ניקוי אופטי משנות את האופן שבו רקמות נראות. גישות אלה מאפשרות לחקור לעומק את תכשירי האיברים השלמים, ומספקות תובנה עצומה לגבי הארגון המבני של רקמות בבריאות ובחולי. טכניקות כגון החלפת ליפידים שקופים אקרילאמיד היברידית רקמה תואמת הדמיה קשיחה (CLARITY) משיגות מטרה זו על ידי מתן מטריצה הקושרת ביומולקולות חשובות תוך מתן אפשרות לליפידים המפזרים אור להתפזר בחופשיות. הסרת שומנים, ואחריה התאמת מקדם שבירה, הופכת את הרקמה לשקופה וניתנת להדמיה בקלות ב-3 מימדים (תלת מימד). עם זאת, ניקוי הרקמות האלקטרופורטיות (ETC) ששימש בפרוטוקול CLARITY המקורי יכול להיות מאתגר ליישום בהצלחה והשימוש בפתרון קנייני להתאמת אינדקס שבירה מייקר את השימוש בטכניקה באופן שגרתי. דוח זה מדגים את היישום של פרוטוקול ניקוי אופטי פשוט וזול המשלב CLARITY פסיבי לשיפור שלמות הרקמות ו-2,2′-thiodiethanol (TDE), פתרון התאמת מקדם שבירה שתואר בעבר.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת לדמות מבנים נוירו-אנטומיים שלמים היא בעלת ערך עצום להבנת המוח בבריאות ובחולי. באופן מסורתי, הדמיה תלת מימדית דרשה חתך רקמות כדי לספק את הרזולוציה הצירית וכדי לדמיין מבנים אנטומיים עמוקים. גישה זו יכולה לייצר מערכי נתונים ברזולוציה גבוהה, אך דורשת טכניקות שחזור תמונה מתוחכמות והיא עתירת עבודה. כתוצאה מכך, הוא הוגבל להדמיה של נפחים קטנים של רקמה1-3. חתך אופטי, לעומת זאת, מתאים היטב ליצירת תמונות תלת מימד ברזולוציה גבוהה של רקמות המסומנות בפלואורסצנט. מכיוון שחתך אופטי הוא תלת מימדי מטבעו, הוא אינו דורש חישוב נרחב כדי לייצר נפח תמונה תלת מימדי. עם זאת, פיזור אור ואטימות רקמות מגבילים את העומק שבו ניתן לחתוך רקמות אופטית. עומק ההדמיה מוגבל לכ-150 מיקרומ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בוצעו בהתאם טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) הנחיות. Thy1-YFP, PLP-EGFP ו- PV-tdTomato עכברים ששימשו בניסויים אלה, אבל כל בעכברים המבטאים חלבוני ניאון ניתן לפנות בהצלחה צילמו.

1. רקמות הכנה

זהירות: Paraformaldehyde (PFA) ו acrylamide רעילים מגרים. בצע ניסויים ניצול ריאגנטים אלה במנדף ועם ציוד מגן אישי מתאים (חלוק, כפפות, ומשקפי מגן).

  1. להקריב את החיה בתא המתת חסד עם ~ 1 מ"ל של isofl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לדמיין את המבנה הארגוני של המוח הוא קריטי להבנת איך מורפולוגיה וקישוריות להשפיע על תפקוד המוח בריאות ומחלות. טכניקות סליקה אופטיות מאפשרות אוכלוסיות תאי תמונת 3D ברקמות ללא פגע, מה שמאפשר לנו ללמוד מורפולוגיה וקישוריות cohesively.

עכברים המבטאים חלבוני ניאון מונע על ידי יזמים ספציפיים עבור תת-אוכלוסיות של תאים להתיר אחת ניסו להפריד דפוס המורכב של ק.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סליקה פסיבית של רקמות מוטבעות הידרוג'ל (CLARITY הפסיבי) היא שיטה פשוטה וזולה לניקוי חתיכות גדולות של רקמה. גישה זו אינה דורשת ציוד ייעודי וניתן לבצעו בקלות שייקר בקרת טמפרטורה. במשך תקופה של כמה שבועות, אפילו גדולים, רקמות myelinated ביותר, כגון המוח כולו או בחוט השדרה, יהפוך שקוף ומתאים מיקרוסקופיה. למרות דוח זה התמקד סליקת רקמות CNS, ניתן ליישם CLARITY הפסיבית לכל רקמה.

את נקודות החוזק והחולשה היחסיות של טכ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על בנדיבות על ידי המכונים הלאומיים לבריאות / המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NIH / NINDS) מענק 1R01NS086981 וקרן הילטון קונרד נ. אנו מודים לד"ר לורן בן-טולילה וד"ר מתיו Schibler על עזרתם שלא יסולא בפז עם מיקרוסקופיה confocal. אנו מודים לאלה שתרמו בפורום CLARITY (http://forum.claritytechniques.org). אנחנו במיוחד להודות לד"ר קרל דייזרות עבור פתיחת המעבדה שלו ללמד טכניקה המרתק הזה. המחברים מודים על התמיכה הנדיבה של מינהל המחקר הרפואי למיפוי המוח, קרן תמיכה למיפוי המוח, פירסון-לאבלייס קרן, קרן Ahmanson, קרן הצדקה של חברות קפיטל גרופ, וויליאם מ ולינדה ר Dietel פילנתרופית קרן, קרן Northstar . מחקר מדווח בפרסום ז....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x פוספט חוצץ מלח (PBS)פישרBP399-1חוצץ
32% פרפורמלדהיד (PFA)מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים15714-5זלוף והידרוג'ל
2,2'-תיודיתנול (TDE)סיגמא-אולדריץ'166782-500Gתמיסת התאמת מקדם שבירה
40% אקרילאמידביו-ראד161-0140הידרוג'ל
2% ביס-אקרילאמידביו-ראד161-0142יוזם הידרוג'ל
VA-044Wako Pure Chemical Industries, Ltd.VA044הידרוג'ל
חומצה בוריתסיגמא-אולדריץ'B7901מאגר פינוי
נתרן דודציל סולפט (SDS)פישרBP166-5מאגר פינוי
נתרן הידרוקסידפישר55255-1חוצצים
נתרן אזידסיגמא-אולדריץ'52002-100Gחומר משמר
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'X100-500 גרםחוצצים
הפריןסיגמא-אולדריץ'H3393-50KUזילוף
נתרן חנקתיפישרBP360-500זלוף
DAPIבדיקות מולקולריותD1306כתם גרעיני
99.9% איזופלורןפיניקס57319-559-06
חומצה הידרוקולוריתפישרA1445-500חוצצים
צלחת תחתית זכוכיתWillcoHBSB-5040כלי Willco
דבק רב פעמיBostick371351Blu-Tack
סיליקון אלסטומרWorld Precision InstrumentsKWIK-CASTKwik-Cast
מגבון ללא מוךKimberly-Clark34120KimWipe
Mouse מטריצת מוחRobozSA-2175רקמת
חתךלהבי מטריקסRobozRS-9887רקמת חיתוך
משאבה פריסטלטיתCole-Parmer77122-24pefusion
סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מיקרוסקופיהLeicaSP5
תוכנת הדמיהLeicaLASמיקרוסקופיה
הרדמה AF

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  2. Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical ClearingPassive CLARITYMouse Central Nervous SystemTissue TransparencyRefractive Index MatchingLipid RemovalHydrogel PolymerizationConfocal Microscopy2 2 ThiodiethanolImaging Chamber

Related Articles