Method Article

Denervation כירורגי עורית: שיטה לבדיקת הדרישה עצבה בעכברי מודל של מחלת עור

DOI:

10.3791/54050

⸱

June 26th, 2016

 ,  , 
1Dermatology, Cell and Developmental Biology, University of Michigan, 2Dermatology Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה כולל פרוטוקולים מפורטים לתיוג גנטי של עור עכבר, ניתוק עצבים כירורגי, ביופסיית עור והדמיה של אפיתל מסומן על ידי צביעת β-גלקטוזידאז שלמה. ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי לבדוק את הדרישה לעצבים במודלים של עכברים בעלי עור רגיל ופתולוגי.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצבים סומטוסנסוריים עוריים מתפקדים כדי לזהות גירויים מגוונים הפועלים על העור. בנוסף לתפקידיהם החושיים המבוססים, מחקרים אחרונים הציעו כי עצבים עשויים גם לווסת הפרעות עור כולל אטופיק דרמטיטיס, פסוריאזיס וסרטן. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לבדיקת הדרישה לעצבים בשמירה על איבר מכני-סנסורי עורי, כיפת המגע (TD). באופן ספציפי, אנו דנים בשיטות לתיוג גנטי, קציר והדמיה של TDs על ידי צביעה שלמה, ולביצוע ניתוק עצבים כירורגי חד צדדי על עור הגב האחורי של העכבר. יחד, ניתן להשתמש בגישות אלה כדי להשוות ישירות את המורפולוגיה של TD וביטוי גנים בעור מנותק עצבים כמו גם בעור המופעל על ידי דמה מאותה חיה. ניתן גם להתאים שיטות אלה בקלות כדי לבחון את הדרישה לעצבים במודלים של פתולוגיה של העור בעכברים. לבסוף, היכולת לדגום שוב ושוב את העור מספקת הזדמנות לעקוב אחר התקדמות המחלה בשלבים ובזמנים שונים לאחר התחלתה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך השנים האחרונות חלה הערכה הולכת וגוברת להשפעת העצבים על מחלות שאינן נחשבות בדרך כלל לנוירופתיות קלאסיות1-4. בעור, עדויות ניסיוניות עדכניות הצביעו על כך שעצבים תחושתיים יכולים לווסת פתולוגיות מגוונות החל מפסוריאזיס ועד לסרטן5-9. זה הוכח באמצעות טכניקות כמו ניתוק עצבים כירורגי ועיכוב פרמקולוגי של תפקוד עצבי במכרסמים. במקרה של פסוריאזיס, מחקרים אלה סיפקו מסגרת מכניסטית להבנת מדוע פלאק פסוריאזי אנושי נסוג בעקבות אובדן תפקוד עצבי7,10-12.

עצבים עוריים יכולים גם להשפיע על ביטוי גנים13,14 והם קריטיים לחישה מכנית בעור רגיל15. בפרט, אפיתל כיפת מגע (TD) מורכב מטלאי של תאי אפידרמיס עמודיים בס....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים המתואר בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם לתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת מישיגן היחידה לרפואת חיות מעבדה.

1. להשרות שחלוף עכברים

הערה: Gli1 TM3 (cre / ERT2) Alj / J זן העכבר (Gli1-CreERT2) 13 מאפשר מיקוד של שחלוף הנגרמת טמוקסיפן כדי TD epithelia. לחצות זן זה עם B6.129S4-GT (ROSA) 26Sor tm1Sor / עכברים הכתב J (LacZ) 22 כדי ליצור Gli1; ​​חיות LacZ לדמיין תאים TD ידי כל הר מכתים להלן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על ידי עכברי יצירה להביע טמוקסיפן-מושרת Gli1-CreERT2 ו אלל כתב LacZ, אפשר לדמיין epithelia TD ולעקוב אחר גורלם של תאים אלה לאורך זמן. הליך denervation כולו בדרך כלל ניתן להשלים בתוך 1 hr לכל עכבר וצריך לגרום למצוקה מינימאלית לחיה.

המחקרים הקודמים שלנו הראו כי עצבים חיוניים לשמירה הן TDs רגיל וכן תאי קרטין 8 + מרקל הקשור.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עצבים לשרת פונקציות חיוניות לא רק תחושה, אלא גם בפיתוח איבר יונק, בשמירה ובחידוש 13,24-27. כפי עצבים היו מעורבים לאחרונה בהפרעות עור מגוונות, הטכניקות המתוארות כאן יכולות לשמש כדי לחקור את דרישת העצבוב במגוון דגמי המחלה בבעלי החיים. למעשה הטכניקה denervation חד-צדדית מאפשרת השוואה ישירה של העור או עם העצבים שלא ניזוקו או שיבשו מאותו עכבר. זה מספק בקרה פנימית אידיאלית כדי לפצות על הבדלים חי אל-חיה, עם הנתונים הבאים מנתחת עשיית שימוש של מבחן t מזווג.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים רוצים להודות לסתיו פיטרסון על הסיוע בצילום עכברים, לדניאל תורסן על הסיוע בעכברים, ולד"ר ניקול וורד ועבד אלמג'יד בלקאדי על הסיוע בניתוק עצבים כירורגי. מחקרים אלה נתמכו על ידי מימון מהמכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור (מענקים R00AR059796 ו-R01AR065409); המחלקה לדרמטולוגיה של אוניברסיטת מישיגן; תוכנית המלגות למדעי הביולוגיה; המרכז לאורגנוגנזה; מרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת מישיגן; וקרן הסרטן ע"ש ג'ון ס. וסוזן ס. מון. S.C.P. נתמך על ידי מימון מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (מענק T32 GM007315). עבודה זו נתמכה גם על ידי תוכנית המחקר הפנימי של ה-NIH, המרכז לחקר הסרטן, המכון הלאומי לסרטן.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
רפידות הכנה לאלכוהולPDIB339
AnaSed (קסילזין)LloydNADA 139-236
נוגדן, אנטי קרטין 8מחקרים התפתחותיים Hybridoma BankTROMA-Iנוגדן חולדות, שימוש בריכוז 1:500
נוגדן, אנטי קרטין 17Cell Signaling#4543נוגדן ארנב, שימוש בריכוז 1:1,000
נוגדן, אנטי-נוירופילמנטאיתות תאיםC28E10נוגדן ארנב, שימוש בריכוז 1:500
רפידות הכנה בטדין MedlineMDS093917
קרפרופן (רימדיל)Zoetis
קוצץ נטען אלחוטיגוזם Wahlדגם 8900
שמן תירסSigma-AldrichC8267
CryostatLeicaCM1860
DAPIThermoFisher ScientificD1306שימוש בריכוז 1:1,000
דאוקסיכולטסיגמא-אולדריץ'D6750
קרם אפילציהNairN/A
דימתילפורמידסיגמא-אולדריץ'319937
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)סיגמא-אולדריץ'D8418
GlutaraldehydeSigma-AldrichG5882
ImmEdge עטוקטור מעבדותH-4000
קטמין HClHospiraNDC 0409-2051-05
מגנזיום כלורידSigmaM8266
מיקרו כיסוי זכוכיתVWR48404-454
מיקרו שקופיותVWR48311-703
10% פורמלין ניטרלי חוצץVWRBDH0502-4LP
6-0 תפרי ניילוןDemeTECHNL166012F4P
אוקטילפניל-פוליאתילן גליקולסיגמא-אולדריץ'I8896
O.C.T. תרכובתSakura Tissue-Tek4583
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Pottasium ferrocyanideSigma-AldrichP9387
Pottasium ferricyanideSigma-Aldrich702587
נתרן פוספט מונו-בסיסיSigma-AldrichP9791
נתרן פוספט דו-בסיסיSigma-AldrichS5136
סוכרוזSigma-Aldrich84097
טמוקסיפןSigma-AldrichT5648-1G
מלקחיים עדינים במיוחדDumont0103-5-PO
VectashieldVector LaboratoriesH1000
X-galRoche10 651 745 001להמיס בדימתילפורמיד ליצירת מלאי פי 50 לפני השימוש

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Magnon, C., et al. Autonomic nerve development contributes to prostate cancer progression. Science. 341, 1236361(2013).
  2. Zhao, C. M., et al. Denervation suppresses gastric tumorigenesis. Sci Transl Med. 6, 115(2014).
  3. Chiu, I. M., von Hehn, C. A., Woo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cutaneous Surgical DenervationMouse Skin DiseaseTouch Dome MorphologyDorsal Cutaneous NerveWhole Mount StainingGenetic LabelingSham Operated ControlHistological Section AnalysisHedgehog SignalingMerkel Cells

Related Articles