ג'ין-מיקוד mutagenesis ניתן כיום במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות טכניקות עריכה הגנום. הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול mutagenesis גן ממוקד באמצעות מפעיל שעתוק כמו nucleases המפעיל (TALENs) ב Astyanax mexicanus, זן של דגים הכולל דגי שטח cavefish.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
זיהוי אללים של גנים העומדים בבסיס השינוי האבולוציוני חיוני להבנת כיצד ומדוע מתרחשת אבולוציה. לקראת מטרה זו, עבודות רבות שנעשו לאחרונה התמקדו בזיהוי גנים מועמדים לאבולוציה של תכונות במגוון מינים. עם זאת, עד לאחרונה היה מאתגר לאמת פונקציונלית גנים מועמדים מעניינים. כלים שפותחו לאחרונה להנדסה גנטית מאפשרים לבצע מניפולציות על גנים ספציפיים במגוון רחב של אורגניזמים. יישום טכנולוגיה זו באורגניזמים רלוונטיים מבחינה אבולוציונית יאפשר תובנה חסרת תקדים לגבי תפקידם של גנים מועמדים באבולוציה. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) הוא מין של דג בעל צורות שוכנות על פני השטח ומערות. קווים עצמאיים מרובים של צורות שוכני מערות התפתחו מדגי שטח קדומים, שהם פוריים זה עם זה ועם דגי פני השטח, מה שמאפשר הבהרת הבסיס הגנטי של תכונות המערות. A. mexicanus שימש למספר מחקרים אבולוציוניים, כולל ניתוח קישורים לזיהוי גנים מועמדים האחראים למספר תכונות. לפיכך, A. mexicanus היא מערכת אידיאלית ליישום עריכת גנום לבדיקת תפקידם של גנים מועמדים. כאן אנו מדווחים על שיטה לשימוש בנוקלאזות אפקטור דמויות מפעיל שעתוק (TALENs) למוטציה של גנים במשטח A. mexicanus. עריכת גנום באמצעות TALENs ב-A. mexicanus שימשה ליצירת מוטציות בגנים של פיגמנטציה. ניתן להשתמש בטכניקה זו גם כדי להעריך את תפקידם של גנים מועמדים למספר תכונות אחרות שהתפתחו בצורות מערות של A. mexicanus.
מבוא
הבנת הבסיס הגנטי של אבולוצית תכונה היא מטרת מחקר ביקורתית של ביולוגים אבולוציוניים. התקדמות ניכרת כבר עשתה בזיהוי לוקוסים שבבסיס האבולוציה של תכונות ואיתור גני מועמדים בתוך לוקוסים אלה (למשל 1-3). עם זאת, מבחינה תפקודית לבחינת התפקיד של הגנים הללו נותר מאתגרים כמו אורגניזמים רבים המשמשים ללימוד האבולוציה של תכונות אינן כיום גנטי צייתניות. הופעתו של טכנולוגיות עריכת הגנום גדלה מאוד manipulability הגנטי של מגוון רחב של אורגניזמים. Nucleases מפעיל מפעיל דמוי תמלול (TALENs) ומקובצים interspaced בקביעות חזרות palindromic קצר (CRISPRs) שימשו כדי ליצור מוטציות ממוקדות בגנים בכמה אורגניזמים (למשל 4-11). כלים אלה, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הנהלים כל חיה היו בהתאם להנחיות של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב ואושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת אייווה ואוניברסיטת מרילנד.
1. עיצוב Talen
- הקלט הרצוי רצף היעד לאתר אינטרנט עיצוב Talen. (לדוגמא: https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen ). קלט נבחר spacer / חוזר אורכי מערך.
- העתק את רצף הגנום ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
זריקות זוג Talen לגרום מחייב של RVDs כדי דנ"א ספציפי ובכך dimerization של תחומי FokI, וכתוצאה מכך הפסקות גדילים כפולות 39 אשר ניתן לתיקון באמצעות קצה שאינו הומולוגי שהצטרף (NHEJ). NHEJ לעתים קרובות מציג שגיאות שיוצרות תוספות או השמטות (indels). Indels ניתן לזהות על ידי הגברה באזור המקיף את אתר היעד Talen ושמע את amplicon וכתוצאה עם אנזים הגבלה שחותך בתוך האזור spacer Talen. אללים ללא indel יהיו לעכל תוך אללים המכילים indels.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
צעדים גדולים נעשו בשנים האחרונות כלפי בהבנת הבסיס הגנטי של האבולוציה של תכונות. בעוד גני מועמדים שבבסיס האבולוציה של מספר התכונות זוהו, היא נותרה מאתגרת לבדוק גנים אלה in vivo בשל חוסר העקיבות גנטית של מינים המעניינים ביותר מבחינה אבולוציונית. כאן אנו מדווחים על שיטה לעריכה הגנום א mexicanus, זן לשמש כדי לחקור את האבולוציה של בעלי חיים במערה. מיפוי גנטי לומד 1,21,23 ו גן מועמד גישות 19,40 זיהה מספר גני מועמדים לאבולוציה של תכונות בצורת המערה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי המחלקה לגנטיקה, פיתוח ביולוגיה של התא ו איווה סטייט ועל ידי EY024941 מענק NIH (WJ) .Dr. ג'פרי Essner ספק הערות על כתב היד.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ציוד | |||
| Thermocycler | |||
| הזרקת תחנת | |||
| ג'ל מכשיר | |||
| מושך | |||
| Nanodrop | |||
| שם | <חזק> Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| הערה: ככל הידוע לנו, ניתן להשתמש באספקה מחברות שונות אלא אם כן צוין | |||
| Golden Gate TALEN ו-TAL Effector Kit 2.0 | Addgene | Kit #1000000024 | |
| פישר ביו-ריאגנטים LB אגר, מילר (מגורען) | פישר | BP9724-500 | |
| פישר ביו-ריאגנטים מיקרוביולוגיה מדיה: מרק LB, מילר | פישר | BP1426-500 | |
| Teknova TET-15 ב-50% EtOH | Teknova (הוזמן דרך פישר) | 50-843-314 | |
| ספקטינומיצין דיהידרוכלוריד, פישר ביו-ריאגנטים | פישר | BP2957-1 | |
| סופר אמפיצילין (פי 1,000 פתרון) | DNA Technologies | 6060-1 | |
| ThermoScientific X-Gal Solution, מוכן לשימוש | Thermo Sci Fermentas Inc (הוזמן דרך פישר) | FERR0941 | |
| IPTG, פישר ביו-ריאגנטים | פישר | BP1620-1 | |
| צלחות פטרי | פישר | 08-757-13 | |
| BsaI | ניו אינגלנד ביולאבס (הוזמן דרך פישר) | 50-812-203 | השתמש ב-BsaI, לא ב-BsaI-HF (כמתואר בפרוטוקול Golden Gate TALEN ו-TAL Effector Kit) |
| BSA | New England Biolabs | סיפקה אנזימי | |
| 10x T4 ligase buffer | Promega (הוזמן דרך פישר) | PR-C1263 | |
| GoTaq Green Master mix | Promega (הוזמן דרך פישר) | PRM7123 | ניתן להשתמש ב-Taq אחר, אך יש להתאים את התגובה בהתאם |
| ערכת קשירה מהירה | New England Biolabs (הוזמן דרך פישר) | 50-811-728 | אנו משתמשים ב-Quick Ligase לכל תגובות ההרכבה של TALEN |
| One Shot TOP10 Chemical Qualified E.coli | Invitrogen | C4040-06 | ניתן להשתמש בתאים מוכשרים אחרים מבחינה כימית או בתאים מוכשרים תוצרת בית |
| Esp 3I | Thermo Sci Fermentas Inc (הוזמן דרך פישר) | FERER0451 | |
| DNase Epicentre תלוי ATP בטוח לפלסמיד | (הוזמן דרך פישר) | NC9046399 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | יש להשתמש בערכת Qiagen להכנת הפלסמיד הראשונית (כמתואר בפרוטוקול Golden Gate TALEN ו-TAL Effector Kit) |
| ערכת טיהור QIAquick PCR Qiagen | 28104 | ||
| GeneMate LE מתמוסס במהירות Agaraose | BioExpress | E-3119-125 | |
| Sac I | Promega (הוזמן דרך פישר) | PR-R6061 | |
| mMESSAGE mMACHINE T3 ערכת תמלול | אמביון | AM1348M | |
| Rneasy MinElute ערכת ניקוי | Qiagen | 74204 | |
| NorthernMax-Gly טעינת דגימה צבע | אמביון (הוזמן דרך פישר) | AM8551 | |
| Eliminase | Decon (הוזמן דרך פישר) | 04-355-32 | |
| פישרברנד חד פעמי סודה-ליים זכוכית פסטר פיפטס | פישר | 13-678-6B | |
| נימי זכוכית סטנדרטיים | מכשירי דיוק עולמיים | 1B100-4 | |
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0010 | |
| טיפים למיקרו-מעמיס Eppendorf Femtotips עבור Femtojet Microinjector | Eppendorf (הוזמן דרך פישר) | E5242956003 | |
| נתרן הידרוקסיד | פישר | S318-500 | |
| טריס בסיס | פישר | BP152-1 |
מקורות
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nat Genet. 38 (1), 107-111 (2006).
- Hoekstra, H. E., Hirschmann, R. J., Bundey, R. A., Insel, P. A., Crossland, J. P. A single amino acid mut....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
