Técnicas de evolución y de aislamiento de adaptación se describen y se demostraron para producir derivados de la cepa Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 que son capaces de consumir rápidamente azúcares hexosa y pentosa mixtos en enzima sacarificadas hidrolizados undetoxified y acumular más de 40 g / L de etanol.
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Artículo de método
Las técnicas para la Evolución de la robusta levaduras que fermentan la pentosa para la bioconversión de lignocelulosa en etanol
En este artículo
Resumen
Resumen
La biomasa lignocelulósica es una materia prima abundante y renovable útil para la producción de etanol de grado combustible y otros bioproductos. Los procesos de pretratamiento y sacarificación enzimática liberan azúcares que pueden ser fermentados por la levadura. Las levaduras industriales tradicionales no fermentan xilosa (que comprenden hasta un 40% de azúcares vegetales) y no pueden funcionar en hidrolizados concentrados. Los hidrolizados concentrados son necesarios para respaldar la recuperación económica de etanol, pero están cargados de subproductos tóxicos generados durante el pretratamiento. Si bien los métodos de desintoxicación pueden hacer que los hidrolizados sean fermentables, son costosos y generan responsabilidades de eliminación de desechos. Aquí, se describen y demuestran técnicas de evolución adaptativa y aislamiento para producir derivados de la cepa nativa de Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 que son capaces de convertir eficientemente los hidrolizados en etanol económicamente recuperable a pesar de las condiciones adversas de cultivo. Los individuos mejorados se enriquecen en una población en evolución utilizando múltiples presiones de selección que dependen de la diversidad genética natural de la población de S. stipitis y mutaciones inducidas por la exposición a dos hidrolizados diferentes, etanol o radiación UV. Los cultivos de evolución final se diluyen para cosechar los aislados predominantes, mientras que las poblaciones intermedias, congeladas en glicerol en varias etapas de evolución, se enriquecen en medios selectivos utilizando gradientes de estrés apropiados para recuperar los aislados más prometedores a través de la siembra por dilución. Los aislados se seleccionan en varios tipos de hidrolizado y se clasifican utilizando un procedimiento novedoso que involucra transformaciones adimensionales del índice de rendimiento relativo (RPI) de la tasa de absorción de xilosa y los datos de rendimiento de etanol. Utilizando el parámetro estadístico RPI, se calcula un promedio de rendimiento relativo general para clasificar los aislados en función de múltiples factores, incluidas las condiciones de cultivo (que varían en nutrientes e inhibidores) y las características cinéticas. Mediante la aplicación de estas técnicas, los derivados de la cepa parental tuvieron las siguientes características mejoradas en los hidrolizados sacarificados enzimáticos a pH 5-6: reducción de la fase de retraso inicial que precede al crecimiento, reducción del retraso diáxico durante la transición glucosa-xilosa, tasas de fermentación significativamente mejoradas, mejor tolerancia al etanol y acumulación a 40 g/L.
Introducción
Se estima que 1,3 millones de toneladas secas anuales de biomasa lignocelulósica podrían apoyar la producción de etanol y permitir que los EE.UU. para reducir su consumo de petróleo en un 30%. 1 Aunque la biomasa vegetal mezclas de los rendimientos de hidrólisis de azúcar ricos en glucosa y xilosa, inhibidores de la fermentación son generados por el pretratamiento químico necesario para descomponer hemicelulosa y celulosa para exponer ataque enzimático. ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural y (HMF) se cree que son componentes clave entre muchos inhibidores que se forman durante el pretratamiento. Con el fin de mover la industria del etanol lignocel....
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Protocolo
1. Preparar los materiales de partida y Equipo para ensayos
- Preparar hidrolizados utilizando 18 a 20% de peso seco de biomasa inicial en la reacción de tratamiento previo para el uso en la evolución, el aislamiento y procedimientos de clasificación. Ver Slininger et al. 2015 18 para los métodos detallados para preparar AFEX CSH, PSGHL, y SGH con suplementos de nitrógeno N1 o N2 utilizados en la evolución, el aislamiento o la clasificación. Véase la Tabla 1 para la composición de cada tipo de hidrolizado.
NOTA: fortificaciones de nitrógeno de SGH fueron designados como SGH-N1 o SGH-N2 definen como sigue: SGH-N1 = ....
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Resultados
S. stipitis se desarrolló usando combinaciones de tres cultivos de selección, que incluían AFEX CSH, PSGHL, y cultivo continuo xilosa alimentado etanol-desafiado. La figura 1 muestra el diagrama esquemático de los experimentos de evolución realizadas junto con los aislados encontrar ya sea para realizar con mayor eficacia en general, o más eficazmente en uno de los hidrolizados de probadas. Tabla 3 muestra los números de NRRL de adhesión de estas cepas superiores y resume las t.......
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Discusión
Varias medidas fueron cruciales para el éxito del proceso de la evolución. En primer lugar, es la clave para elegir las presiones de selección apropiados para conducir la evolución de la población hacia los fenotipos deseados que se necesitan para la aplicación exitosa. Los siguientes tensiones selectivos fueron elegidos para S. stipitis desarrollo y aplicado en los momentos apropiados para guiar enriquecimiento para los fenotipos deseados: el aumento de puntos fuertes de 12% glucano AFEX CSH (que fuerza el cre.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Nos gustaría expresar nuestro sincero agradecimiento a los Dres. Kenneth Vogel, Robert Mitchell y Gautam Sarath, Unidad de Investigación de Granos, Forraje y Bioenergía, Servicio de Investigación Agrícola, Lincoln, NE por su amable suministro de pasto varilla para este proyecto. También agradecemos al Departamento de Energía de los EE. UU. por la financiación de VB a través de la subvención DE-FC02-07ER64494 del Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos (GLBRC) del DOE.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cellic Ctec, contiene xilanasa (endo-1,4-) | Novozymes | Sin número | de producto www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, contiene celulasa y xialanasa | Novozymes | Sin número de producto | : www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Harina de Nutrisoy Tostada | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Tensioactivo) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Ensayo vitamínico Ácidos Casamino | Becton Dickinson and Company | 228830 | múltiples proveedores: p. ej., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-triptófano | Sigma-Aldrich | T3300 | múltiples proveedores: p. ej., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cisteína | Sigma-Aldrich | C7352 | múltiples proveedores: p. ej., , Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | múltiples proveedores: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | varios proveedores: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Extracto de levadura Bacto | Becton Dickinson and Company | 212750 | múltiples proveedores: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptona Tipo IV de soja | Fluka | P0521-500g | múltiples proveedores: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenina, >99% en polvo | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5. Podría usar otras marcas. Múltiples proveedores: p. ej., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, >99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7. Podría usar otras marcas. Múltiples proveedores: p. ej., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5. Podría usar otras marcas. Múltiples proveedores: p. ej., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4. Podría usar otras marcas. Múltiples proveedores: p. ej., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8. Podría usar otras marcas. Múltiples proveedores: p. ej., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrosa (D-glucosa), Anhidro, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7. Podría usar otras marcas. Múltiples proveedores: p. ej., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, ensayo >99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6. Podría usar otras marcas. Múltiples proveedores: p. ej., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| de 96 pocillos, placas de fondo plano | Becton Dickinson Falcon | 351172 | varios proveedores: p. ej., Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Toalla | Kimberly-Clark | en cajas de microplacas para absorber agua para la humidificación; varios proveedores p. ej., Thermo-Fisher, uline, | |
| matraz de pyrex graduado Daigger Corning, 125 ml, apertura estrecha (tapón #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | varios proveedores: p. ej., Thermo-Fisher, VWR, agitador |
| /incubadora Daigger Innova 42R, rotación de 2,5 cm (1") | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | varios proveedores: p. ej., Eppendorf, Thermo-Fisher. Se pueden utilizar otros agitadores/incubadoras con un alcance de 2,5 cm (1"). |
| Abrazadera de cubierta Duetz para placas MTP de 4 pozos profundos | Z365001700 applikon-biotechnology.com Applikon Biotechnology | (EE. UU.), 1-650-578-1396 | |
| Cubierta sándwich Duetz System para placas de 96 pozos profundos | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (EE. UU.), 1-650-578-1396 |
| Sello de silicona Duetz System (0,8 mm negro Low Evap) para tapa de placa de 96 pocillos profundos | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (EE. UU.), 1-650-578-1396 Capa de |
| microfibra azul para cubierta de sándwich del sistema Duetz | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (EE. UU.), 1-650-578-1396 |
| 96 pocillos, placas de fondo piramidal de pocillos cuadrados de 2 ml, popypropileno natural | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 applikon-biotechnology.com (EE. UU.), 1-650-578-1396 | |
| Tapones de esponja de silicona Bellco de 32 mm, paquete de 25 para matraces de 125 ml | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, su número de catálogo es 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealed Flange Type, 100 ml volumen de trabajo. Este diseño ya no se fabrica. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Los recipientes encamisados tienen puertos de entrada inferior y salida superior para el control de la temperatura con baño de agua circulante. Los recipientes tienen un diámetro exterior de 75 mm y una altura de 200 mm. Hay cuatro puertos laterales en ~45° ángulos y un puerto superior. Aberturas de puerto del tamaño adecuado para tapones de neopreno de tamaño 0 (diámetros interiores de 21-22 mm en los puertos). |
| Mathis Labomat IR Secador Horno | MathisAg | Typ-NBR BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Analizador bioquímico de doble canal | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, sistema robótico para el ensayo rápido de azúcares en formato de microplaca |
| PowerWave XS Espectrofotómetro de microplaca PowerWave XS | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
Referencias
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeas....
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Reimpresiones y permisos
