الرنا الميكروية تلعب الدور التنظيمي المهم والناشئة كأهداف علاجية جديدة لمختلف الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تبين أن تتم miRNAs في البروتينات الدهنية عالية الكثافة. لقد قمنا بتطوير طريقة مبسطة لعزل بسرعة HDL النقي مناسبة لتحليل ميرنا من البلازما البشرية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة سريعة والمبسطة لارتفاع العزلة من خلال وضع-من ميرنا من نظافة البروتين الدهني عالي الكثافة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
RNAs الصغيرة غير المشفرة (miRNAs) متورطة في مجموعة متنوعة من الأمراض البشرية بما في ذلك متلازمات التمثيل الغذائي. يمكن استخدامها كمؤشرات حيوية للتشخيص والتشخيص أو قد تكون بمثابة أهداف لتطوير الأدوية ، على التوالي. لقد ثبت مؤخرا أن miRNAs يتم حملها في البروتينات الدهنية ، وخاصة البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL) ويتم تسليمها إلى الخلايا المتلقية لامتصاصها. هذا يثير احتمال أن تلعب miRNAs دورا مهما ومحوريا في الوظيفة الخلوية والأعضاء من خلال تنظيم التعبير الجيني بالإضافة إلى الرسول للاتصالات الخلوية والخلية والحديث المتبادل بين الأعضاء. الطرق الحالية لعزل miRNA من HDL المنقى غير عملية عند استخدام عينات صغيرة على نطاق واسع. هذا يرجع إلى حد كبير إلى الطرق الشاقة التي تستغرق وقتا طويلا والمستخدمة لعزل البروتين الدهني. لقد طورنا نهجا مبسطا لعزل HDL المنقى بسرعة مناسب لتحليل miRNA من عينات البلازما. يجب أن تسهل هذه الطريقة التحقيقات في دور miRNAs في الصحة والمرض ، وعلى وجه الخصوص توفر رؤى جديدة حول مجموعة متنوعة من الوظائف البيولوجية ، خارج النقل العكسي للكوليسترول ، التي تنسب إلى HDL. أيضا ، يمكن أن توفر أنواع miRNA الموجودة في HDL معلومات قيمة عن المؤشرات الحيوية السريرية لتشخيص الأمراض المختلفة.
المقدمة
MicroRNAs هي أنواع RNA صغيرة داخلية غير مشفرة محفوظة بشكل كبير وتعتبر لاعبين رئيسيين في تنظيم العمليات البيولوجية المختلفة عن طريق تحطيم أو قمع الحمض النووي الريبي المرسال المستهدفالمحدد 1. نظرا لأن miRNAs تعمل داخل الخلايا ، فقد تم استكشافها كمؤشرات حيوية مشتقة من الأنسجة مما أدى إلى اكتشاف الوظائف الخاصة بالأنسجة لهذه miRNA. ومع ذلك ، تم العثور على miRNAs أيضا خارج الخلية إما مرتبطة بالبروتينات أو في الإكسوسومات / الحويصلات الدقيقة التي يمكن أن تحميها بشكل فعال من التدهور بواسطة RNases خارجالخلية 2. أظهرت الدراسات الحديثة أن التأثير الوقائي ل HDL قد لا يكون مرتبطا ارتباطا وثيقا بقدرته على تعزيز تدفق الكوليسترول ولكن بالأحرى بحمولته غير الكولي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. جمع عينات الدم
- جمع الصيام عينات من الدم الوريدي المحيطية إلى 10 مل الأنابيب البلاستيكية التي تحتوي على حمض تخثر Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (التي لديها العديد من المزايا أكثر من مضادات التخثر الأخرى) من خلال بزل الوريد القياسية من الوريد بارز في الحفرة المرفقية.
- أجهزة الطرد المركزي لعينات الدم في 1600 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي الطاولة للحصول على البلازما خالية من خلايا الدم الحمراء وكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عزل البروتين الدهني العالي الكثافة بعد إزالة Exosomes
للحصول ميرنا من HDL عالي النقاء فمن الضروري إزالة exosomes التي تمثل مصدرا للتلوث ميرنا 7. وقد تم ذلك قبل تنبيذ فائق الكثافة التدرج مع مجموعة المتاحة تجاريا. لأغراض عملية تم تعديل معيار بروتوكول تنبيذ فائق الكثافة التدرج ثلاث خطوات التي وضعتها شركة تجارية (الشكل 1). يتطلب هذا البروتوكول الطرد المركزي مع الدوار زاوية ثابتة بسرعة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتحديد المؤشرات الحيوية جديدة من الدم تساعد في التشخيص السريري والتشخيص للأمراض المختلفة. لقد عرف الرنا الميكروية لامتلاك كل الصفات من المؤشرات الحيوية وثبت في دراسات مختلفة 14-17. في هذه الدراسة أننا أظهرنا طريقة سهلة سريعة وبسيطة لعزل ميرنا من HDL البلازما. كثافة التقليدية التدرج طريقة فائقة الطرد المركزي من العزلة من VLDL، LDL و HDL يعتمد على عينات دقيقة من البلازما، وإعداد دقيق للحل العازلة، وقياس الكثافة ونقل كمية من كسور البروتين الدهني أسفل 8. هناك طرق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل ، كليا أو جزئيا ، من قبل NIH Grants R01 AA 020758-04 و U01DK 061731-13 و T32 DK 007150-38 إلى AJS و T32 DK 007150-38 إلى AA. هذا عمل أصلي وليس قيد النظر في مكان آخر للنشر.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| البلاستيك Vacutainer لافندر K2EDTA الأنابيب | بيكتون وديكنسون وشركاه | 366643 | |
| الطرد المركزي | Thermo Scientific و Sorvall Legend X1R & nbsp ؛ | 75004261 | |
| Densito 30PX مقياس الكثافة | Mettler Toledo | MT51324450 | |
| ExoQuick solution | Invitrogen | 4484451 | |
| البولي كربونات سميكة الجدران أنبوب الطرد المركزي | الفائق Thermo Scientific | O3237 | |
| Sorvall WX100 أجهزة الطرد المركزي الفائقة | Thermo Scientific | 46902 | |
| Fat Red 7B | سيجما ألدريتش | 201618 | |
| β-mercaptoethanol | الطرد المركزي Sigma-Aldrich | ||
| Amicon Ultra-15 10K | Millipore | UFC901008 | |
| Amicon أجهزة تصفية الطرد المركزي الفائق 3K | Millipore | UFC800308 | |
| QuickGel Lipo kit | مختبرات هيلينا | 3344،3544T | |
| معايير البروتين الدهني البشري ل VLDL و LDL و HDL | LipoTrol ؛ مختبرات هيلينا | 5069 | |
| Rep Prep buffer | مختبرات هيلينا | 3100 | |
| RNeasy MinElute أعمدة الدوران | محلل Qiagen | ||
| NanoDrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| CFX96 نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي | BioRad | ||
| miRNeasy Serum / Plasma Kit | QIAGEN | 217184 | |
| miScript Primer Assays | QIAGEN | 141078139 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | QIAGEN | 218073 | |
| miRNeasy مصل / بلازما سبايك في التحكم | QIAGEN | 219610 | |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | ||
| 0.20 &# 181 ؛ مرشح حقنة معقمة | M SIGMA-ALDRICH | Z227536 |
المراجع
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Arroyo, J. D., et al. Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma. <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
عزل البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL)تحليل الحمض الريبي النووي الميكروي (miRNA)الطرد المركزي الفائق بتدرج الكثافةتريب إكسوسوماتتنقية البروتينات الدهنيةإجراء إزالة الأملاحالفصل الكهربائي للهلام بالأجاروزتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real-time PCR)جزء البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL)عينات البلازما
