מחקר זה משווה שתי שיטות שונות של בידוד מונוציטים אנושיים להשגת תאים דנדריטיים במבחנה (DCs). מונוציטים נבחרים על ידי היצמדות או מועשרים לרעה על ידי הפרדה מגנטית. תפוקת מונוציטים וכדאיות יחד עם כדאיות MDDC, התפשטות וביטוי סמני פני השטח CD11c/CD14 יושוו בין שתי השיטות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אפיון של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים ידי cytometry זרימת הדמיה: השוואה בין שני פרוטוקולי בידוד מונוציטים
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאים דנדריטיים (DCs) הם תאים המציגים אנטיגן של מערכת החיסון הממלאים תפקיד מכריע בתגובות לימפוציטים, מנגנוני הגנה של המארח ופתוגנזה של דלקת. בידוד ומחקר של DCs היו חשובים במחקר הביולוגי בגלל המאפיינים הייחודיים שלהם. למרות שהם מתווכים מרכזיים חיוניים של מערכת החיסון, DCs נדירים מאוד בדם, ומהווים כ-0.1 - 1% מכלל התאים החד-גרעיניים בדם. לכן, חלופות לשיטות בידוד מסתמכות על התמיינות של DCs ממונוציטים המבודדים מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs). שימוש בטכניקות בידוד מתאימות המשלבות פשטות, סבירות, טוהר גבוה ותפוקה גבוהה של תאים הוא הכרחי לשקול. במחקר הנוכחי יושוו שתי שיטות שונות ליצירת DCs. מונוציטים נבחרו על ידי היצמדות או הועשרו שלילית באמצעות הליך הפרדה מגנטית ואחריו התמיינות ל-DCs עם IL-4 ו-GM-CSF. כדאיות, התפשטות ופנוטיפ של מונוציטים ו-MDDC הוערכו באמצעות צבעי כדאיות, בדיקת MTT וניתוח סמני משטח CD11c/CD14 על ידי הדמיית ציטומטריית זרימה. למרות ששיטת ההפרדה המגנטית הניבה אחוז גבוה משמעותית של מונוציטים בעלי יכולת התפשטות גבוהה יותר בהשוואה לשיטת ההדבקה, הממצאים הוכיחו את היכולת של שתי הטכניקות לייצר בו זמנית מונוציטים המסוגלים להתרבות ולהתמיין ל-CD11c+ MDDCs ברי קיימא לאחר שבעה ימים בתרבית. שתי השיטות הניבו >-70% CD11c+ MDDCs. לכן, התוצאות שלנו מספקות תובנות התורמות לפיתוח שיטות אמינות לבידוד ואפיון של DCs אנושיים.
מבוא
תאים דנדריטים (DCS) הם מתווכים חיוניים של מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הן מתפקדות לגרום תגובה חיסונית ראשונית להקל על הפיתוח של זיכרון אימונולוגי. תאים אלה אחראים בעיקר עבור לכידת אנטיגן, הגירת גירוי תא T ולכן מכונים תאי מציגי אנטיגן מקצועיים כמו (נגמ"שים) 1 .Manipulation של DCs יכול להיות מנוצל על פני מגוון רחב של תחומי מחקר במסגרת הקלינית לטיפול שונה מחלות דלקתיות כגון HIV 6,7, סרטן 8, מחלות אוטואימוניות 9, ותגובות אלרגיות 10. DCs גם בשימוש למחקר התמכרות לסמים ואלכוהול על מנת לפתור מנגנונים לא ידועים מסלולים כגון אלה הקשורים בתלות באלכוהול 11-14, תל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
בסך הכל מחקרי דם אדם כבר נבדקו ואושרו על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי (IRB) של FIU, פרוטוקול IRB אישור # IRB-13-0440. leukopaks אדם נרכש מבנק דם הקהילה במיאמי, פלורידה.
1. ניתוק של PBMCs ידי טכניקת שיפוע צפיפות תקן
- בצע דילול 1: 1 של דם עם מי מלח 1X פוספט שנאגר בבקבוק T75.
- פיפטה 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות לתוך 50 מ"ל צינורות צנטריפוגות שכבת בזהירות (25 - 30 מ"ל / צינור) של דם מדולל על שיפוע זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תשואת מונוציטים ידי פרדה מגנטית גבוהה בהשוואת תשואת מונוציטים ידי דבקות שיטה
נתונים המוצגים PBMC תצוגת איור 1 וספירת תאים מונוציטים בשיטת הרחקת trypan הכחולה על היום של בידוד של PBMCs ופרדה של מונוציטים. בממוצע, מונוציטים מבודדים בשיטת דבקות היוו כ 6.2 אחוז PBMCs הכולל תוך מונוציטים מבודדים על-ידי הפרדה מגנטי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בהתבסס על הקשיים הידועים של בידוד ויצירת MDDCs מדם אדם, המחקר הנוכחי נועד לספק השוואה מקיפה של שתי שיטות ומבוססות עבור הדור של MDDCs. השיטה הראשונה לעומת שיטה מסורתית ומבוססת להפקה MDDCs תוך ניצול היכולת של מונוציטים לדבוק זכוכית או פלסטיק (שיטת הדבקות) 21,22,27. השיטה הדבקה היא מהירה וחסכונית, ואינו דורשת שימוש בציוד מורכב. עם זאת, כמה חסרונות של התהליך הזה כוללים זיהום לימפוציטים, גמישות נמוכה, 22,30,31 מניפולציה חולפת מונוציטים. שיטת החלופה השנייה לעומת הי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
כל המחברים אינם מגלים אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי להתמכרות לאלכוהול ואלכוהוליזם, פרס K99/R00 AA021264. תמיכה נוספת במעבדה כחלק מחבילת הסטארט-אפ התקבלה מהמחלקה לאימונולוגיה, המכון לפרמקולוגיה נוירו-אימונית, מכללת הרברט ורטהיים לרפואה ו-FIU- המשרד למחקר ופיתוח כלכלי. ג'יאנה קסטלירו נתמכה על ידי NIH/NIGMS R25 GM061347. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | יש להשתמש ב-RT |
| Phosphate-buffered מלח (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK מאגר ליסינג | איכות ביולוגית | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 טכנולוגיות חיים בינוניות | 22400-089 | ||
| טכנולוגיות חיים אנטיביוטיות-אנטימיקוטיות (100x) | Life | 15240-062 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| מאגר RoboSep | StemCell | 20104 | |
| ערכת העשרת מונוציטים אנושיים EasySep StemCell | 19059 | ||
| TC20 מונה תאים אוטומטי | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| כתם כחול טריפן (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| קורא רב-מצבי סינרג'י 2 | Biotek | 7131000 | |
| XTT ביו-ריאגנט מלח נתרן (XTT) | סיגמא אולדריץ' | X4626-100MG | |
| ביורגנט דימתיל סולפוקסיד (DMS) | סיגמא אולדריץ' | D8418-500ML | |
| תיאזוליל כחול טטרזוליום ברומיד (MTT) | סיגמא אולדריץ' | m5655-500MG | |
| נתרן דודציל סולפט (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| פנאזין מתוסולפט (DMSO) | סיגמא אולדריץ' | P9626-1G | |
| סרום אנושי מומת (HI) | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 זרימה ציטומטר | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis זרימה ציטומטר | EMD Millipore | 100300 |
מקורות
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Banchereau, J., Stein....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
