Методология с высокой пропускной способностью, автоматизированное, табачных протопластов производство и преобразование описано. Роботизированная система позволяет массово-параллельной экспрессии генов и открытие в модельной системе BY-2, которая должна быть переводимым не-модельных культур.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Роботизированной платформы для высокой пропускной способности выделения протопластов и трансформации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
За последнее десятилетие наблюдается всплеск в использовании растительных протопластов, которые варьируются от модельных видов подрезать видов, для анализа путей передачи сигнала, транскрипционных регуляторных сетей, экспрессии генов, генома редактирования и гена-глушителей. Кроме того, значительный прогресс был достигнут в регенерации растений из протопластов, породившей еще больший интерес к использованию этих систем для растений геномики. В этой работе, протокол был разработан для автоматизации изоляции протопластов и трансформации из «Ярко-желтый '2 (BY-2) табака суспензионной культуры с использованием роботизированной платформы. Процедуры трансформации были подтверждены с использованием оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) ген-репортер (pporRFP) под контролем промотора вируса мозаики цветной капусты 35S (35S). ОФП выражение в протопласты было подтверждено эпифлуоресцентной микроскопии. Анализы также включены протопластов методы эффективности производства с использованием propidiuм йодистый. И, наконец, недорогие ферменты пищевые были использованы для процедуры выделения протопластов, обходя необходимость лабораторного класса ферментов, которые непомерно в высокой пропускной способности автоматизированной изоляции и анализа протопластов. На основании протокола, разработанного в данной работе, полная процедура от выделения протопластов к трансформации может быть проведена в соответствии с 4 ч, без какого-либо вмешательства оператора. В то время как протокол, разработанный в данной работе была подтверждена с клеточной культурой BY-2, процедуры и методы должны быть переводимым к любой подвески растений культуры / протопластов системы, которая должна позволить ускорению исследований в области геномики культур.
Введение
В последние годы наблюдается значительный импульс уделяется разработке трансгенных культур для преодоления различных заболеваний 1, наделяют устойчивость к гербицидам 2, придают засуху 3,4 и солеустойчивости 5, предотвратить herbivory 6, увеличить выход биомассы 7, и уменьшение клеточной стенки упрямство 8. Эта тенденция способствовала развитию новых молекулярных инструментов для создания трансгенных растений, в том числе генома редактирования с использованием CRISPR и Таленс 9 и молчанием генов через дсРНК 10, микроРНК 11 и миРНК 12. Несмотря на т....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Создание суспензионных клеточных культур
- Готовят жидкость × 2 сред путем добавления 4,43 г Linsmaier & Скоог основных сред, 30 г сахарозы, 200 мг KH 2 PO 4, и 200 мкг 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) до 900 мл дистиллированной воды и рН до 5,8 с помощью 0,1 М КОН. После доведения рН, регулировать конечный объем до 1000 мл дистиллированной водой и автоклаве. Средства массовой информации могут храниться до 2-х недель при 4 ° С.
- Привить колбу 250 мл Эрленмейера с 100 мл жидкости-2 СМИ и одного куска BY-2 каллуса (> 1 см в диаметре), выращенных на твердом теле-2 сред (жидкости-2 средах с добавлением 1% агар) и печать....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В текущем исследовании, удвоение скорости BY-2 изменялась от 14-18 ч в зависимости от температуры, при которой инкубировались культуры, в соответствии с предыдущими сообщениями о средней продолжительности клеточного цикла 15 ч. При этом скорость удвоения, 1: 100, начиная прививочный материал был использован для инициации культур, что приводит к культурам с гематокрита (PCV) 50% в течение 5-7 дней. В текущем протоколе, в котором культуры выращивают в 200 мл носителе, PCV 100 мл сгенериров.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, описанный выше, был успешно проверен для выделения протопластов, перечисления и трансформации с использованием табака культуры суспензии клеток BY-2; Тем не менее, протокол может быть легко расширена на любое растение подвески культуры. В настоящее время протопластов выделение и преобразование было достигнуто во многих растениях, в том числе кукурузы (Zea MAYS) 10, морковь (морковь дикая) 32, тополь (тополь евфратский) 33, винограда (Vitis винифер.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Это исследование было поддержано Агентством перспективных исследовательских проектов - Энергетика (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Orbitor RS Микропланшетный движитель | Thermo Scientific | ||
| Bravo Обработчик жидкостей | Многорежимный | ||
| Synergy H1 Многорежимный диспенсер | BioTek | ||
| MultiFlo FX Многорежимный диспенсер | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Нагреватель/охладитель | Inheco | ||
| Программное обеспечение Vworks Automation | Программное обеспечение Agilent | используемое для управления и написания протоколов для Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Программное обеспечение для планирования задач для управления Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Программное обеспечение | Biotek | используемое для управления и написания протоколов для | |
| инвертированного микроскопа MultiFlo FX IX81 | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap Микроскоп | камера Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Набор фильтров | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | бутылка для образцов | недорогая целлюлаза |
| Rohapect UF | AB Enzymes | для образца | для образца недорогая пектиназа |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | бутылка для образца | недорогая пектиназа/арабиназа |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| пропидиум йодид | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(этиленгликоль) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | ранее Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Акрос Органик |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Ацетат натрия | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Сахароза | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-луночная пластина | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-луночная пластина глубиной 1,2 мл Thermo | Scientific | AB-0564 | |
| 96-луночная оптическая нижняя пластина | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Наконечники для пипеток | с широким отверстиемThermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
Ссылки
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
