자질 체외 ATP 아제 활동

Chelsea S. Rule; Marcella Patrick; Maria Sandkvist

doi:10.3791/54305

Method Article

자질 체외 ATP 아제 활동

DOI:

10.3791/54305

⸱

August 23rd, 2016

Chelsea S. Rule¹ , Marcella Patrick¹ , Maria Sandkvist¹

¹Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan

Summary

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체외 ATPase 활성을 정량화하기 위한 기본 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 주어진 정제된 ATPase에 대한 활성 수준 및 요구 사항에 따라 최적화할 수 있습니다.

Abstract

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아데노신 삼인산 가수 분해 효소, 또는 -ATPase를는 세포 기능의 다양한 배열에 중요한 역할을한다. 이러한 동적 단백질은 단백질 인신 매매 및 저하, 용질 수송, 및 세포의 움직임과 같은 기계적인 작업을위한 에너지를 생성 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 기능적 특성화 -ATPase를 정제의 시험 관내 활성을 측정하기위한 기본적인 분석이다. 단백질은 무기 포스페이트 방출을 초래 반응의 ATP 가수 분해 및 유리 된 인산의 양은 다음 비색 정량 분석법을 사용한다. 이것은 고도로 적응 프로토콜 운동 또는 엔드 포인트 분석에서 ATP 아제 활성을 측정하기 위해 조정될 수있다. 대표적인 프로토콜이 활동과 EPSE의 요구 사항에 따라 여기에 제공되면, AAA + ATP 아제는 박테리아 비브리오 콜레라를 입력 II 분비에 관여. 활성을 측정하기 위해 필요로 정제 된 단백질의 양을 분석의 길이와 SA의 타이밍 및 횟수mpling 간격, 버퍼 소금 조성, 온도, 공동 요인, 각성제 (있는 경우) 등이 여기에 설명하는 것과 다를 수 있습니다, 따라서 약간의 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 프로토콜의 특성 -ATPase를위한 기본 틀을 제공하고 신속하게 수행하고 쉽게 필요한 조절 될 수있다.

Introduction

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ATPase는 모든 생명계의 많은 과정에서 필수적인 효소입니다. ATPase는 ATP 가수분해 에너지를 사용하여 단백질 이동, 풀림 및 조립과 같은 다양한 반응에 동력을 공급하는 분자 모터 역할을 합니다. 복제 및 전사; 세포 대사; 근육 움직임; 세포 운동성; 및 이온 펌핑^1-3. 일부 ATPase는 막을 가로질러 용질을 운반하는 데 관여하는 막관통 단백질이고, 다른 ATPase는 세포질이며 원형질막(plasma membrane) 또는 소기관(organelle)과 같은 생물학적 막과 관련될 수 있습니다.

AAA+ ATPases (다양한 세포 활동과 관련된 ATPases)는 일부 서열 및 구조적 보존을 공유하는 큰 ATPase 그룹을 구성합니다. 이러한 단백질은 Walker-A 및 -B box와 같은 보존된 뉴클레오티드 결합 모티프를 포함하고 활성 상태에서 올리고머(일반적으로 헥사머)를 형성합니다¹. 뉴클레오티드 결합에 대한 이러한 단백질의 큰 구조적 변화는 AAA+ 계열의 다양한 구성원 사이에서 특성화되었습니다. EpsE는 AAA+ ATPase이며 NTPase^4-6의 박테리아 Type II/IV 분비 아과에 속합니다. EpsE는 콜레라의 원인 병원체인 비브리오 콜레라(Vibr....

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Protocol

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1. 정제 된 단백질과 ATP 가수 분해 반응을 수행

정제 된 단백질과 부화에 필요한 모든 시약의 주식을 준비합니다.
1. 100 mM의 HEPES pH가 8.5, 65 mM의 염화나트륨, 5 % 글리세롤 (또는 다른 분석 완충액 적절한)을 함유하는 배 HEPES / 염화나트륨 / 글리세롤 (HNG) 버퍼를 준비한다.
2. 물 (ATP 아제 금속에 의존하는 경우, 또는 다른 금속) 100 밀리미터의 MgCl _{2를 준비합니다.}
3. 고순도 ATP를 사용 (추가하여 pH를 조정하지 않음) 200 mM 트리스 자료에서 신선한 100 mM의 ATP를 준비합니다. 나누어지는이 ATP가 시간이 지남에 따라 분해되므로, 몇 주 이상 더 이상 -20 ° C에서 ATP 재고를 저장하고, 동결 및 ATP 재고를 해동을 삼가합니다.
4. 1에서 프리믹스의 MgCl _2, ATP : 1의 비율로 바로 ATP의 가수 분해 반응을 설정하기 전에.
조제 및 반응에 걸쳐 일정한 간격으로 샘플을 수집하는 1.5 ㎖의 튜브 라벨. 시간 0 시간 15, 30에서 샘플을 수집하기 위해 튜브를 준비,45 및 60 분.
참고 : 다른 방법으로, 유일한 시간 0 엔드 포인트에서 ....

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Results

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T2S ATP 아제 EPSE의 생체 외 활동은 세포질 EpsL (EPSE-cytoEpsL)의 도메인과 산성 인지질 카디오 리핀 ^(12)의 추가와 함께 EPSE의 copurification에 의해 자극 될 수있다. 또한이 분석을 사용하여 단백질의 변이체 형태를 야생형 (WT)의 활성을 비교함으로써 ATP 가수 분해에 EPSE 특정 잔기의 역할을 결정하는 것도 가능하다. 여기서, EPSE 아연 결합 도메인에 두 개의 리신 잔기로 치환하는 효과가 K417AK419A EPSE-cytoEpsL 변이체를 정제 WT EPSE-cytoEpsL의 ATP 아제 활성을 비교함으로써 측정된다. 도 1에서, 포스페이트 방출은 1 시간 역학적 분석, 운동 ATP 아제 활성의 정확한 정량을위한 요구 사항에 걸쳐 선형 진행한다. 이중으로 세 번 분석하고 정량화 된도 1과 같은 정제 된 단백질 시료

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Discussion

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이 생화학 적 특성에 대한 정제 된 단백질의 생체 외 ATP 아제 활동 측정하는 일반적인 프로토콜입니다. 이 방법은 쉽게 최적화되어 있습니다; 예를 들어, 단백질, 완충 염 및 조성물, 온도, 및 상기 분석과 다양한 길이 (간격의 총 개수를 증가 포함) 간격의 양을 조절하는 활성을 정량을 향상시킬 수있다. 시판 말라카이트 그린 기반의 시약은 매우 민감, 무료 인산 소량 검출 할 수있다 (~ 100 μl의 50 pmol의). 따라서 분석의 민감도, 일회용 플라스틱 제품, 초순수, 완충제, 인산염 오염없는 시약을 사용하는 것이 중요하다. 단백질 정제 후, 크기 배제 또는 이온 교환 크로마토 그래피는 단백질의 순도를 향상시키고 불순물을 제거하기 위해 권고된다.

시험관 ATP 아제 활성이 약한 표시 단백질, 각성제 전자를 향상시키기 위해 반응에 첨가 될 수있다nzymatic 활동. ATP 아제 활성을 자극하는 많은 요소.......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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저자는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 RO1AI049294(M. S.에게)의 자금 지원에 감사를 표합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES 완충액	Fisher	BP310-500
염화나트륨	Fisher	BP358-212
염화마그네슘	Fisher	BP214-500
아데노신 삼인산(ATP)	Fisher	BP41325
96웰 플레이트(투명, 평면 바닥)	VWR	82050-760
BIOMOL Green	Enzo Life Sciences	BML-AK111	선호 인산염 검출 시약. 주의: 자극성.
마이크로플레이트 리더			BioTek Synergy 또는 유사한
Prism 5	GraphPad 소프트웨어

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15....

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