Entwicklung eines Insert Co-Kultursystem von zwei Cellular Typen in der Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt

Zusammenfassung

In mehrzelligen Organismen lösen sekretierte lösliche Faktoren Reaktionen von verschiedenen Zelltypen als Ergebnis der parakrinen Signalübertragung aus. Insert-Co-Kultursysteme bieten eine einfache Möglichkeit, die Veränderungen zu beurteilen, die durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt vermittelt werden.

Zusammenfassung

Die Rolle von sezernierten löslichen Faktoren bei der Modifikation zellulärer Reaktionen ist ein wiederkehrendes Thema in der Erforschung aller Gewebe und Systeme. In dem Versuch, die sehr komplexen Beziehungen zwischen den verschiedenen zellulären Subtypen, aus denen sich mehrzellige Organismen zusammensetzen, zu verdeutlichen, wurden In-vitro-Techniken entwickelt, die den Forschern helfen, ein detailliertes Verständnis einzelner Zellpopulationen zu erlangen. Bei einer dieser Techniken werden Einsätze mit einer durchlässigen Membran verwendet, die es den sezernierten löslichen Faktoren ermöglichen, zu diffundieren. So kann eine Population von Zellen, die in Inserts gezüchtet wurden, in einer Vertiefung oder Schale, die einen anderen Zelltyp enthält, co-kultiviert werden, um zelluläre Veränderungen nach parakriner Signalübertragung in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt zu bewerten. Solche Insert-Co-Kultursysteme bieten verschiedene Vorteile gegenüber anderen Co-Kulturtechniken, nämlich bidirektionale Signalübertragung, konservierte Zellpolarität und populationsspezifische Detektion zellulärer Veränderungen. Neben ihrer Verwendung im Bereich der Entzündung, des Krebses, der Angiogenese und der Differenzierung sind diese Co-Kultursysteme von größter Bedeutung für die Erforschung der komplizierten Beziehungen, die zwischen den verschiedenen zellulären Subtypen im Zentralnervensystem bestehen, insbesondere im Zusammenhang mit der Neuroinflammation. Dieser Artikel bietet allgemeine methodische Richtlinien für den Aufbau eines Experiments, um zelluläre Veränderungen, die durch sezernierte lösliche Faktoren vermittelt werden, unter Verwendung eines Insert-Co-Kultursystems zu bewerten. Darüber hinaus wird ein spezifisches Protokoll zur Messung der neuroinflammatorischen Wirkungen von Zytokinen, die von Lipopolysaccharid-aktivierten N9-Mikroglia auf neuronale PC12-Zellen sezerniert werden, detailliert beschrieben, was ein konkretes Verständnis der Insert-Co-Kultur-Methodik bietet.

Einleitung

Die Untersuchung von Geweben, Organen oder Systemen in vitro ist ein Versuch , die sehr komplexen Beziehungen zwischen den verschiedenen Zellsubtypen bestehenden zu vereinfachen , die mehrzellige Organismen umfassen. Tatsächlich in - vitro - Studien ermöglichen es , ein detailliertes Verständnis der einzelnen Zellpopulationen zu erwerben. Es gibt zwei Hauptvorteile von in vitro Experimenten Durchführung: 1) zellulare Wechselwirkungen reduziert, und 2) die Fähigkeit, leicht die zelluläre Umgebung manipulieren. Daher haben diese beiden Vorteile erlaubt, das Verhalten von spezifischen Zelltypen in vivo vorherzusagen, zu der F....

Protokoll

NB: Jeder der folgenden Schritte sollten unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, wie für Säugetierzellkultur erforderlich. Darüber hinaus gelten die allgemeinen Richtlinien für die optimale sterile Zellkultur, z. B., Tipps jederzeit verwerfen sie zu Kreuzkontaminationen führen kann, die Verringerung der Menge an Zeit , Zellen der Luft ausgesetzt werden , wenn ganze Medienwechsel durchführen, richtig , aber vorsichtig alle Rühren Zellsuspensionen ihre homogene Pipettieren, um sicherzustellen, etc. Darüber hinaus Einsätze eine Art von Plastikmaterialien, die eine besondere Behandlung erfordern. Erstens, wenn Einsätze manipul....

Ergebnisse

Die Verwendung von Einsatz Co-Kultursystemen ist besonders relevant bei der Untersuchung von neuroinflammatorischen Prozesse, die parakrine Beziehungen zwischen verschiedenen zellulären Spieler des ZNS zeigen. Immunität im ZNS erfolgt in erster Linie von den ansässigen Zellen genannt Mikroglia, die ihre Umwelt in ihrem Ruhezustand verästelten (2A) zu überwachen und sind von Sensorstörungen fähig das könnte Probleme der sehr wertvollen Homöostase notwendig für die richtig.......

Diskussion

Der kritischste Schritt jedes Einsatzes Kokultursystem Experiment verweilt tatsächlich in der richtigen Einsatz Wahl zu verwenden. Die Porengröße und Membranmaterial muss in gründliche Rechnung getragen werden, ohne zu vergessen, die Art der Zellen zu betrachten, und der Zweck des Experiments ausgesät werden. Beispielsweise Kontaktchemotaktische Assays können die gleiche Art von Membran als Zell Kokulturen verwenden, um Zellverhalten Modulationen analysieren induziert durch sekretierte lösliche Faktoren in Abwesenheit v.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI-1640 mittel	Sigma	R8755	Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch
Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium-/Nährstoffmischung F-12 Schinken	Sigma	D6421	Warm in 37 μd; C Wasserbad vor Gebrauch, muss mit 0,365 g/L L-Glutamin ergänzt werden
Pferdeserum	ATCC	30-2040	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Fötales Rinderserum	MultiCell	80350	Warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch
Nerve Growth Factor-7S aus der murinen Submaxillarldrüse	Sigma	N0513	Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver in einer Lösung aus gepufferter Kochsalzlösung oder Gewebekulturmedium mit einem Gehalt von 0,1– 1,0 % Rinderserumalbumin oder 1-10 %
	Sigma	T3924	Warm in 37 μg; C Wasserbad vor Gebrauch
Lipopolysaccharide aus  Escherichia coli  055:B5	Sigma	L2880	Toxische
Zellkultureinsätze für die Verwendung mit 24-Well-Platten	BD Falcon	353095	0,4 μ m Poren
24-Well-Platten	TrueLine	TR5002	Vor Gebrauch mit Kollagen beschichten
Routine PC12 Zellkulturmedium			Routine N9 Zellkulturmedium
-            85% RPMI mittel			-            90% DMEM-F12 mittel
-            10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum			-            10% hitzeinaktiviertes Pferdeserum
-            5% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum
PC12 Differenzierungsmedium			N9 Behandlungsmedium
-              99% RPMI mittel			-            99% DMEM-F12 mittel
-              1% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum			-            1% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum
-              50 ng/mL Nervenwachstumsfaktor
PC12 Behandlungsmedium
-              99% RPMI mittel
-              1 % hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum

Serum-Trypsin-EDTA-Lösung