Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутрисосудистая Поставка биопрепаратов в крысиной почки

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54418

⸱

1 сентября 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Divisions of Cardiovascular Diseases, Department of Internal Medicine, Mayo Clinic, 2Divisions of Nephrology and Hypertension, Department of Internal Medicine, Mayo Clinic

В этой статье

Краткое содержание

Введение препаратов для восстановления функции почек требует контроля локализации и распределения терапевтического соединения. Здесь мы опишем подробно простую технику для внутрипочечной доставки лекарственных средств у крыс. Эта процедура может быть легко выполнена без каких-либо смертности и высокой воспроизводимостью.

Аннотация

Почечный микрососудистый компартмент играет важную роль в прогрессировании заболевания почек и гипертензии, что приводит к развитию терминальной стадии почечной недостаточности с высоким риском смерти от сердечно-сосудистых событий. Более того, недавние клинические исследования показали, что реноваскулярная структура и функция могут оказывать большое влияние на функциональное восстановление почек после операции. Здесь мы опишем протокол доставки лекарств в почечную артерию крыс. Эта процедура имеет значительные преимущества по сравнению с часто используемым системным введением, поскольку она может обеспечить более локализованный терапевтический эффект. Кроме того, использование грызунов в фармакодинамическом анализе доклинических исследований может быть экономически эффективным, прокладывая путь к планированию трансляционных экспериментов на более крупных животных моделях. Используя эту технику, инфузия рекомбинантного белка фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) крыс у крыс индуцировала активацию передачи сигналов VEGF, о чем свидетельствует повышенная экспрессия FLK1, pAKT/AKT, pERK/ERK. Таким образом, мы разработали протокол внутрипочечной доставки лекарств крысам, который является простым и легко воспроизводимым.

Введение

Микроциркуляторное русло почек участвует в широком спектре заболеваний почек. В зависимости от патофизиологии заболевания, эндотелиальные клетки могут иметь структурные или функциональные нарушения, которые могут играть ключевую роль в распространении повреждения почек путем создания ишемизированного микроокружения. Эта почечная микрососудистая дисфункция может стать катализатором прогрессирующего ухудшения функции почек с течением времени, что приводит к хронической болезни почек (ХБП), терминальной стадии почечной недостаточности, гипертензии и кардиоренальному синдрому. На самом деле, нелеченная гипертензия может иметь последствия для почечных артериол, вызывая нефросклероз или гломерулосклероз со значительным снижением объемной фракции сосудов, увеличением сосудистого сопротивления и развитием тубулоинтерстициального фиброза1.

Потеря микроциркуляторного русла почек может быть вызвана измененным сосудистым гомеостазом, вызванным дисбалансом местных ангиогенных/антиангиогенных факторов. Это коррелирует с ослаблением передачи сигналов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), а также с повышенным уровнем тромбоспондина-12-4. Таким образом, с использованием различных животных моделей (мышей, крыс и свиней) недавно был исследован терапевтический эффект экзогенного введения VEGF при некоторых формах почечной недостаточности, демонстрирующих снижение интерстициального фиброза и стабилизацию функции почек и сердца3-5. Этот эффект, вероятно, обусловлен действием VEGF на эндотелиальные клетки микрососудистого русла и переключением фенотипа воспалительных моноцитов6.

Для некоторых доклинических исследований использование грызунов, наиболее часто используемых лабораторных животных, обеспечивает хорошую животную модель для высокопроизводительных исследований из-за относительно низких затрат и простоты в обращении. Более того, использование генетически измененных крыс в качестве моделей человеческих заболеваний, таких как гипертония, становится все более частым в научном сообществе. Таким образом, целью данного протокола является описание полезной внутрипочечной техники доставки VEGF у крыс, которая проста в исполнении и высоко воспроизводима. Более того, этот же метод может быть использован для избирательной доставки других препаратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты проводились на самках крыс Sprague-Dawley, весом 250-300 г. Все процедуры на животных соответствуют стандартам, изложенным в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных животных ресурсов, Национальной академии наук, Bethesda, MD, США) и были одобрены Mayo Clinic Медицинского колледжа Уходу за животными и использование комитета (IACUC).

1. Подготовка

  1. Автоклав все хирургические инструменты, перед хирургическим вмешательством. Если несколько операций на различных крыс планируются в тот же день, промойте инструменты после каждой процедуры животного, а затем стерилизовать с помощью горячего шарика стерилизатор.
  2. Обезболить крыса с 4% изофлуран в 1 л / мин O 2.
  3. Передача крысе контролируемой грелку, чтобы сохранить температуру тела при 37 ° C. Поддержание анестезии с 1-2% изофлуран в 1 л / мин O 2.
  4. Администрирование анальгетик (бупренорфин с пролонгированным высвобождением 0,6 мг / кг) суbcutaneously.
  5. Нанесите мазь для глаз, чтобы предотвратить высыхание во время процедуры.
  6. Для того, чтобы компенсировать потерю жидкости в организме из-за лапаротомии, важно вводить 10 мл / кг 0,9% нормального солевого раствора подкожно перед операцией.
  7. Бритье области живота и очистить кожу с повидон-йода и 70% этанола колодками.

2. Хирургические процедуры

  1. Убедитесь, что глубина седации адекватна путем мониторинга физических рефлексов, таких, как выход из пальца пинч, пальпебрального рефлекса, челюсть тон, и частота дыхания / схеме.
  2. Выполните лапаротомии через небольшой разрез (срединный 2-2,5 см в длину) с помощью хирургического скальпеля лезвия № 10.
  3. Извлеките кишечник и толстый кишечник с правой стороны живота с помощью ватного тампона и накрыть их стерильной марлей, смоченной в 0,9% физиологического раствора, чтобы поддерживать органы во влажном состоянии.
  4. Аккуратно убирается вверх селезенки, печени, желудка и поджелудочной железы подвергать AORта и левая артерии почки.
  5. С помощью хирургического микроскопа, тщательно отделить брюшную аорту выше и ниже левой почки и левой почечной артерии из вен, жир и окружающей соединительной ткани с тупыми Препарировальный изогнутый пинцет и стерильным ватным тампоном.
    1. С помощью пинцета с повторным открываемого-закрываемого движения (отслаивания) вдоль длины сосудов для удаления соединительной ткани и ватные тампоны с движением боковой прокатки, чтобы удалить жир.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рассечение пери-аортального области является очень деликатным шагом, как нервы и лимфатические сосуды могут быть повреждены. Убедитесь в том, чтобы держать артерии влажным физиологическим раствором во время процедуры вскрытия.
  6. Поместите 4-0 шелковый шов под аортой.
  7. Используя микрососудистых зажимы, зажим аорту выше (чуть ниже верхней брыжеечной артерии) и ниже раздвоения почечной артерии.
  8. Прокол аорты на уровне левого kidnEY бифуркация артерии с 24 G внутривенный катетер и продвигать катетер в почечную артерию.
    Примечание: это очень важный шаг, как прокол через почечной артерии может произойти.
  9. Подключение шприц, заполненный лекарственным раствором или физиологическим раствором (до 500 мкл) в катетер и перфузии почек.
  10. Сразу после перфузии, зажать левой почечной вены и левого мочеточника с микрососудистой клипа и удалить катетер. Затем поместите кусок рассасывающиеся кровоостанавливающего желатиновой губки, с небольшим капли клея ткани, над проколотой области аорты и осторожно применять давление с помощью ватного тампона.
  11. В то же время, освободить зажим из брюшной аорты, ниже развилки левой почечной артерии. Через 5 минут, снимите зажим с почечной вены и мочеточника.
  12. Осторожно снимите зажим с аорты, над бифуркацией левой почечной артерии, а также позволяют почечной реперфузии. нет Общая почечная ишемия должна длиться не более 7 мин.
  13. Убедитесь в том, что никакого активного кровотечения не происходит и пристально наблюдать область еще 10 мин.
  14. Закройте брюшной разрез в два слоя (мышц и кожи), используя 4-0 рассасывающиеся нити и непрерывный рисунок, чтобы предотвратить инфекцию. В дополнение к непрерывной технике картины шовного, другой вариант должен был бы использовать простой, прерванный метод, особенно для закрытия стенки тела, чтобы предотвратить расхождение краев.
  15. Применяют мази с антибиотиком по области надреза для предотвращения инфекции.
  16. Перенесите крысу в постельных свободной клетке наблюдения на теплом площадку до полного выздоровления с диапазоном температур, установленной при 35-37 ° С. Сыпучие постельные принадлежности должны быть покрыты (например , с помощью драпировки или бумажным полотенцем) или удалены из клетки , пока животные не будут полностью восстановлены , чтобы предотвратить удушье или аспирации постельных принадлежностей.
  17. После операции, не наблюдать за животными непрерывно до тех пор, дышать спонтанно, а затем ежечасно в течение нескольких часов. Повторная доза Обезболивающее Бупренорфин SR 72 чпозже, если признаки дискомфорта наблюдаются, такие как вялость, сгорбленной и неряшливой, гримасы, не возобновлением нормальной деятельности.
  18. После завершения всех исследований, эвтаназии животных с вдыханием передозировки CO 2 и урожай почечные ткани для ех естественных анализов , таких как гистологии и Вестерн - блоттинга 5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы вводили две различные дозы рекомбинантного VEGF у крыс (rrVEGF, 0,17 мкг / кг и 5 мкг / кг) или PBS. Животных умерщвляли 8 ч после операции, чтобы исследовать активации пути VEGF. Хирургическая процедура не влияет на морфологию перфузией почки (рис 1А) по сравнению с контролем (рис 1 , б), как это показано с помощью H & E окрашивания. В то время как Сириус красный окрашивание не показывали какого - либо увеличения внеклеточн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Растущая заболеваемость хронической болезнью почек вызывает потребность в новых терапевтических подходах, которые могут способствовать функциональному восстановлению почек7,8. Традиционные методы лечения включают системное введение противовоспалительных, антифибротических препаратов9. Однако эти стратегии часто характеризуются нежелательными побочными эффектами из-за нецелевого распределения введенного препарата. Поэтому в данной рукописи мы описываем простую процедуру доставки лекарств в почечную а...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Эта работа выполнена при частичной поддержке исследовательского гранта от Astra Zeneca.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хирургический микроскопLeicaM125
Изофлуран 100 млCardinal HealthcarePI23238Анестетик
Бупренорфин HCL SR LAB 1 мг/мл, 5 млZooPharm PharmacyБупренорфин наркотический анальгетик в составе полимера, замедляющего всасывание, продлевая продолжительность действия (72 часа активности).                                                                                                              Жидкость вязкая, нагревание до RT способствует набору в шприц.                                                                                                                   Рекомендуемая дозировка: 1 - 1,2 мг/кг ск. Не разбавлять.
Puralube Vet Офтальмологическая мазьDechraNDC17033-211-38Стерильная глазная смазка
Lactated Ringer's Injection, USP, 250 мл VIAFLEX Пластиковый контейнерBaxter Healthcare Corp.NDC0338-0117-02Для замены жидкостей организма
Сол Повидон-Йод  Тампон, 3' Cardinal Heatlhcare23405-010B
Аппликаторы стерильные ватные с наконечникамиKendall8884541300
4-0 шелковый шовный материал (без иглы) Зажим для сосуда Cardinal HeatlhcareA183H
, прямой, 0,75 мм x 4 мм JawWorld Precision Instruments 501779-G
Катетер для внутривенного введения, прямой концентратор, рентгеноконтрастный, 24 г x 3/4", FEP PolymerJelco4053
Фосфатный буферный физиологический растворLife Technologies10010023
SURGIFOAM Абсорбируемая желатиновая губкаCardinal Healthcare179082
4-0 VICRYL PLUS (ANTIBACTERIAL) VIOLET 27" RB-1 TAPEREthiconVCP304HДля мышц слой шов
4-0 ВИКРИЛ ПЛЮС (АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ) НЕОКРАШЕННЫЙ 18" PC-3 РЕЖУЩИЙEthiconVCP845GДля наложения швов на слой кожи
Тройная мазь с антибиотикомActavisNDC0472-0179-56Для местного применения на месте разреза
Рекомбинантная крыса VEGF 164 ProteinR& D Sytems564-RV
Кролик моноклональный VEGFAAbcamab46154
Кролик моноклональный FLK1Клеточная сигнализация9698
Кролик моноклональный AKTКлеточная сигнализация4691
Кролик моноклональный фосфоАКТ (Ser 473)Клеточная сигнализация4060
Кролик моноклональный p44/42 MAPK (ERK1/2)Клеточная сигнализация4695
Моноклональный фосфо кролика p44/42 MAPK (Thr202 и Tyr 204)Клеточная сигнализация4370

Ссылки

  1. Dejani, H., Eisen, T. D., Finkelstein, F. O. Revascularization of renal artery stenosis in patients with renal insufficiency. Am. J. Kidney Dis. 36 (4), 752-758 (2000).
  2. Kang, D. H., et al. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: I. Potential role of vascular endothelial growth factor and thrombospondin-1. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1434-1447 (2001).
  3. Kang, D. H., Hughes, J., Mazzali, M., Schreiner, G. F., Johnson, R. J. Impaired angiogenesis in the remnant kidney model: II. Vascular endothelial growth factor administration reduces renal fibrosis and stabilizes renal function. J. Am. Soc. Nephrol. 12 (7), 1448-1457 (2001).
  4. Kang, D. H., et al. Role of the microvascular endothelium in progressive renal disease. J. Am. Soc. Nephrol. 13 (3), 806-816 (2002).
  5. Chade, A. R., Kelsen, S. Reversal of renal dysfunction by targeted administration of VEGF into the stenotic kidney: a novel potential therapeutic approach. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 302 (10), F1342-F1350 (2012).
  6. Eirin, A., et al. Changes in Glomerular Filtration Rate After Renal Revascularization Correlate With Microvascular Hemodynamics and Inflammation in Swine Renal Artery Stenosis. Circ.-Cardiovasc. Interv. 5 (5), 720-728 (2012).
  7. Chade, A. R. Distinct Renal Injury in Early Atherosclerosis and Renovascular Disease. Circulation. 106 (9), 1165-1171 (2002).
  8. Seddon, M., Saw, J. Atherosclerotic renal artery stenosis: review of pathophysiology, clinical trial evidence, and management strategies. Can. J. Cardiol. 27 (4), 468-480 (2011).
  9. Lao, D., Parasher, P. S., Cho, K. C., Yeghiazarians, Y. Atherosclerotic renal artery stenosis--diagnosis and treatment. Mayo Clin Proc. 86 (7), 649-657 (2011).
  10. Sharfuddin, A. A., Molitoris, B. A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury. Nat. Rev. Nephrol. 7, 189-200 (2011).
  11. Noiri, E., et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia. Am. J. Physiol.- Renal Physiol. 281 (5), F948-F957 (2001).
  12. Koesters, R., et al. Tubular Overexpression of Transforming Growth Factor-Î1 Induces Autophagy and Fibrosis but Not Mesenchymal Transition of Renal Epithelial Cells. Am. J. Pathol. 177 (2), 632-643 (2010).
  13. Shanley, P. F., Rosen, M. D., Brezis, M., Silva, P., Epstein, F. H., Rosen, S. Topography of focal proximal tubular necrosis after ischemia with reflow in the rat kidney. Am. J. Pathol. 122 (3), 462-468 (1986).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Доставка через почечную артериювнутрисосудистые биопрепаратыинфузия в почку крысыактивация сигналинга VEGFтехника работы с хирургическим микроскопомвестерн-блот-анализпроцедура окрашивания гематоксилином и эозиномрекомбинантный VEGF крысымодель ишемии-реперфузииналожение микрососудистого зажима
Внутрисосудистая Поставка биопрепаратов в крысиной почки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.