열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

요약

배수성 조작 수정 된 프로토콜은 초기 배아 세포질 분열에 한 사이클 실속을 유도하는 열 쇼크를 사용한다. 이 프로토콜은 제브라에서 설명되지만, 다른 종에도 적용 할 수있다.

초록

배수성의 조작은 diploids에 tetraploids에 diploids, 또는 haploids 유용한 변환, 수 있습니다. 그것은 단일 이형 어머니 동질 접합체의 직접 제작이 가능하기 때문에 제브라 다니오 레 리오의에서는 특별히 동형 gynogenetic diploids 생성 유전자 분석에 유용하다. 이 문서에서는 첫 번째 세포주기, 열 쇼크 2 (HS2) 동안 열 펄스에 따라 배수성 복제에 대한 수정 된 프로토콜을 설명합니다. 중심 소체 복제의 억제를 통해,이 방법은 제 2 셀주기 동안 정확한 세포 분열 스톨 초래한다. 영향을받지 DNA 복제에 결합 정확한 하나의 사이클 부문 스톨은 전체 게놈 중복을 초래한다. 이 방법과 관련된 프로토콜은 하나의 세포주기 분할 지연과 배수성 중복을 일으킬 계란과 정자 수집, 정자의 자외선 치료, 체외 수정 및 열 펄스를 포함한다. 이 프로토콜의 수정 된 버전을 적용 할 수있다다른 동물 종의 배수성 변화를 유도한다.

서론

이 프로토콜은 gynogenetic haploids (그림 1) 또는 tetraploids의 생산에서 동형 접합 gynogenetic diploids의 생성에서와 같이 제브라 피쉬 배아의 배수성의 조작을 할 수 있습니다. 이것은 정확히 하나의 세포주기 (도 2A, 2B)에 대응하는 세포질 분열에 지연을 유도함으로써 달성된다. 세포질 분열의 중요한 한주기 지연은 열 충격으로 처리함으로써 달성된다. 같은 원래 Streisinger에 동료에 의해 설명 열 충격 (HS)의 표준 프로토콜은 최초의 세포주기 ⁽¹⁾ 동안 한주기 세포 분열 마구간의 결과로, 기간 13 ~ 15 MPF 동안 온도 펄스를 포함했다. 이 프로토콜의 효율은 최근 열 충격 처리 슬라이딩 시간 윈도우 초기 세포주기 스캔에 의해 개선되었다. 이 검사는 여전히 최초의 세포주기 (22 ~ 24 MPF) 내에서, 열 충격에 대한 나중에 포인트를 확인하는 EMBR의 높은 비율의 결과이 경우 제 2 ^{셀이 사이클에 영향을주는} 하나의 사이클 세포 분열 실속과 YOS. 제 세포주기 동안 실험 조작은 2 셀 사이클 동안 세포 분열을 방해 DNA를 콘텐츠 복제를 일으킬 관찰은 또한 다른 어류 ^{3,4-보고되었다.<....}

프로토콜

매디슨과 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인 (위스콘신 대학 - - 매디슨 보증 번호 A3368-01) 모든 동물 실험은 위스콘신 대학에 따라 실시 하였다.

1. 중단 된 결합을 통해 계란 컬렉션 여성을 선택

참고 : IVF 기반 프로토콜 수동 압력 ⁹ 여성의 성숙한 계란의 압출에 의존하고 있습니다. 이전 프로토콜 난자 방출 거동을받은 암컷없이 탱크 또는 쌍 교배 직접 암컷을 사용했지만 (제브라 피쉬 라인에 따라 약 20 % 이하)이 여성의 단지 작은 분획은 수동 압력에 압출하고 유능한 계란을 얻었다. 개선 된 절차에서, 여성은 사전 분류 직접 육안으로 달걀 누워 위해, 상대의 즉각적인 중단 다음에 있습니다. 이 절차는 거의 모든 여성이 돌출하고 유능한 계란이 중단 짝짓기 단계 수율을 통해 미리 선택, 매우 효과적이다수동 압력에 따라.

1. 실험 전에 오후, 표준 제브라 피쉬 상대 상자에서 원하는 제브라 피쉬 변형의 결합 쌍을 설정합니다. 상대 상자 분할을 통해 또는 알을 낳는 삽입에서 남성과 삽입 내부에 여성을 배치하여 하나, 아직 물리적으로 분리 여성과 동일한 챔버 내에서 남성을 유지합니다.
2. 그 상대가 시작되도록 실험의 아침, 같은 알을 낳는 삽입 내에서 남성과 여성 모두를 배치, 물리....

결과

한 셀 사이클 토키네 스톨에도 불구하고, DNA 복제 배아 (도 1)의 DNA 콘텐츠의 중복 결과, 예컨대 배아 정상적으로 발생한다. Streisinger에 열 충격 프로토콜 (표준 HS)는 기간 13~15분 게시물 수정 (MPF) 동안 열 펄스를 포함하고 파생 된 방법은 여기에 설명 된 반면, 35 MPF ^{1, 2에서} 첫 번째 배아 세포 분열 동안 주로 세포질 분열 체포를 유도, 열 쇼크 2 (HS2)가, 기간 22 ~ 24 MPF 동안 열 충격을 사용하고 50 MPF (; ^2,3,4 그림 2)에서 두 번째 배아 세포 분열 동안 세포질 분열 체포를 유도라고도합니다. 24 HPF에서 배아의 관찰 그들이 이배체 또는 동형 접합 배체 배아의 정상적인 형태 특성, 또는 반수체 배아의 형태 특성 축 짧고 넓은 몸을 여부를 결정하는 수 (그림 3) .......

토론

중요한 단계

체외 수정에 효과적 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 성숙한 계란 (1 단계)의 좋은 공급을 보장하기 위해, 암컷이 짝짓기에 대한 설정은 적어도 5 일 동안 짝짓기 십자가에 설정 한 안하고 임신하는 표시해야합니다. 사육 중단하는 동안, 관찰자는 자연 계란 압출의 첫 등장에 대해 적절하게 15 ~ 30 탱크를 모니터링 할 수 있습니다. 제 달걀 가장 계란은 IVF 절차에 대한 암컷 내부에 남아 있도록하기 위하여, 자연 교배를 통해 방출 될 때 정합 중단 최대한 빨리 발생한다. 이제 성숙 계란을 수동으로 압출 준비가이 여성은, 이후 계란 릴리스에 명백한 효과없이 최대 2 시간 동안 분리 상태로 유지 될 수있다. 효과적인 정자 용액 (2 단계)를 준비하기 위해, 남성은 강력하고 이상적으로 제브라 피쉬 남성 번식의 특징 인 붉은 색조로 표시됩니다. 깨끗한 절개는 일반적으로 레모을 포함한다신체의 후방 및 전방으로 당겨 수영 방광쪽으로 잡아 당겨 장 트랙을 ving. 중앙 내장.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
제브라피쉬 짝짓기 상자	Aqua Schwarz	SpawningBox1
NaCl	Sigma	S5886
KCl	Sigma	P5405
Na2HPO4	Sigma	S3264
KH2PO4	Sigma	P9791
CaCl< sub>2	Sigma	C7902
MgSO4-7H2O	Sigma	63138
NaHCO3	Sigma	S5761
Tricaine	Western Chemical	Tricaine-D (MS 222)	FDA 승인 (ANADA 200-226)
Tris base	Sigma	77-86-1	1 M Tris pH 9.0 준비
HCl	Sigma	920-1	1 M Tris pH 9.0
물고기 그물 (세밀한 메시) (4-5 인치)	PennPlax	(ThatFishThatPlace # 212370)	는 ThatFishThatPlace에서 사용 가능
표준 상점에서 사용 가능한	플라스틱 스푼
해부 가위	Fine Science Tools	14091-09
해부 집게	Dumont	SS	Fine Science Tools에서 사용 가능
해부, 스테레오스코프(투과 광원 포함),	Nikon	, SMZ645	또는 동급
, 반사 광원(LED 암)	Fostec	KL1600 LED	또는 동급
페트리 플레이트, 직경			모든 제조사
Eppendorf 튜브 1.5ml			모든 제조사
얼음 양동이			모든 제조사
Pipetteman P-1000			모든 제조사
피펫 팁 1,000 µ l			모든 메이커
좁은 주걱	피셔	14-374
우울증 유리판	Corning Inc	722085 (피셔 고양이. No 13-748B)	는 Fisher Scientific
UV l에서	UVP	모델 XX-15 (cat No. UVP18006201)	Fisher Scientific에서 구할 수 있습니다. 이 모델에서는 관찰되지 않았지만 일부 UV 소스는 시간이 지남에 따라 강도가 감소하는 것으로 관찰되었습니다(이 경우 수정 및 문제 해결 참조).
UV 안경			모든 제조사
종이 타월			모든 제조사
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666-11	Fisher Scientific
Timer 스톱워치			에서 구할 수 있습니다.모든 메이커
워시 병	Thermo Scientific		24020500 Fisher Scientific 사에서 구할 수
있습니다 주방 매장에서 사용 가능한	차 여과기
, 비커, 250ml (2)	Corning Inc.	1000250	Fisher Scientific
수조 (2)			0.1 C (예 : >< / em> << sub>2 < / sub >O Bath Series)
Hanks' 용액 1		위의	참조 8.0g NaCl, 0.4g KCl, 100ml ddH2O. 4°C에서 보관하십시오.
행크스의 용액 2	:	참조	0.358 g 무수 Na2< / sub>HPO4< / sub>, 0.6 g KH2 < / sub>PO 4< / sub> 100 ml ddH 2< / sub> O. 4 ° C에 보관하십시오.
행크스의 용액 4	(위 참조		: 50 ml ddH<>2< / sub>O에 0.72 g CaClsub2< / sub> 참조. 4 °C에 보관하십시오.
행크의 프리믹스는	위의 내용을 참조		하고 다음 순서로 추가합니다 : 10.0 ml 용액 1;   1.0 ml 용액 2;   1.0 ml 용액 4;   86.0ml ddH2O;   1.0ml 용액 5. 4 °에 저장; C
행크스의 용액 6	(위 참조		: 10ml ddH<<>>sub2< / sub>O에 0.33g NaHCOsub3< / sub> 참조. IVF 절차 당일 아침에 신선하게 준비하십시오.
Hank's Solution (최종 솔루션)	위 참조		Combine 990 μ 행크의 l ' s 프리믹스 및 10 μ l: 갓 만든 용액 6 (NaHCO3 용액)

로 대부분의 , , 10cm, , , , 사용 가능합니다.amp 은 위 ) )