يصف هذا البروتوكول استخدام الفحص المجهري متعدد الفوتون لإجراء تصوير طويل الأمد عالي الدقة وحيدة الخلية للرئة السليمة في الوقت الفعلي باستخدام نافذة تصوير مستقرة بالفراغ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
على المدى الطويل عالية الدقة حيوي داخلي المجهري في الرئة مع فراغ استقرت النافذة التصوير
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ورم خبيث في المواقع الثانوية مثل الرئة والكبد والعظام هو ذلك الحدث الأليم مع معدل وفيات ما يقرب من 90٪ 1. من هذه المواقع، والرئة هو الأكثر صعوبة في تقييم باستخدام التصوير الضوئي حيوي داخلي بسبب موقف المغلقة في داخل الجسم، والطبيعة الحساسة ودورها الحيوي في الحفاظ على وظائف الأعضاء السليم. في حين طرائق السريرية (التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي (CT)) قادرة على توفير صور موسع من هذا النسيج، أنها تفتقر إلى القرار اللازم لتصور الأحداث المبكرة بذر، مع بكسل واحد تتكون من ما يقرب من ألف الخلايا. النماذج الحالية من الرئة المنتشر البذر الفرضية القائلة بأن الأحداث بعد وصوله إلى الخلايا السرطانية هي حتمية من أجل البقاء والنمو اللاحق. وهذا يعني أن الوقت الحقيقي أدوات التصوير حيوي داخلي لقرار خلية واحدة 2 مطلوبة من أجل تحديد الظواهر من سل البذرليرة سورية واختبار هذه النماذج. في حين عالية الدقة التصوير الضوئي في الرئة وقد تم تنفيذ باستخدام مختلف الاستعدادات خارج الحي، هذه التجارب عادة ما تكون المقايسات واحدة وقت نقطة وعرضة للالتحف واستنتاجات خاطئة محتملة، بسبب البيئة المتغيرة بشكل كبير (درجة الحرارة، وفرة، السيتوكينات، الخ ) الناتجة عن إزالة من تجويف الصدر والدورة الدموية 3. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي الوقت الفاصل بين التصوير الضوئي حيوي داخلي في الرئة سليمة ومن الممكن استخدام فراغ استقرت نافذة التصوير 2،4،5 ومع ذلك، فقد اقتصرت الأوقات التصوير التقليدية إلى ما يقرب من 6 ساعات. نحن هنا وصف بروتوكول للأداء على المدى الطويل التصوير حيوي داخلي الوقت الفاصل بين الرئة باستخدام مثل نافذة على مدى 12 ساعة. تسلسل صورة مرور الزمن تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تمكن التصور والكميات من التفاعلات خلية خلية، وديناميات غشاء ونضح الأوعية الدموية في الرئة. علينا مواصلة دescribe تقنية معالجة الصور التي تعطي رؤية واضحة غير مسبوق من الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة.
المقدمة
وقد ثبت عالية الدقة التصوير الضوئي حيوي داخلي أن تكون حاسمة لفهم العديد من العمليات البيولوجية، مما يسمح للوحيدة الخلية والمعلمات الفرعية الخلوية إلى أن تقاس وكميا. في أبحاث السرطان، وقد أدى التصوير حيوي داخلي من الخلايا السرطانية واللحمية لاكتشاف العديد من التفاعلات microenvironmental 6-11 التي تكون موجودة فقط في الحيوان سليمة.
الاكتشافات حول microenvironments المرتبطة دخول الوعاء ونشر الخلايا السرطانية في سرطان الثدي باستخدام تحليل خلية واحدة التصوير الضوئي في الجسم الحي أدت حتى إلى علامات جديدة لتشخيص والاستجابة للعلاج في مرضى سرطان الثد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تم تنفيذ كافة الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح لاستخدام الحيوانات الفقارية، بما في ذلك موافقة مسبقة من كلية ألبرت أينشتاين للطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.
1. توليد Fluorescently المسمى الفأر نموذج وورم الخلايا
- إعداد 100 مل من 0.1٪ (ث / ت) زلال المصل البقري / الفوسفات مخزنة المالحة (BSA / PBS) عازلة عن طريق خلط 0.1 غرام من BSA مع 100 مل من برنامج تلفزيوني.
- إعداد الخلايا ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
للتدليل على نوع النتائج التي يمكن تحقيقها مع هذا الأسلوب، نحن حقن الخلايا السرطانية E0771-LG المسمى مع البرسيم البروتين الفلوري في الوريد ذيل MacBlue الفئران 44 في متفاوتة نقاط الوقت قبل الجراحة. بعد الجراحة، تم حقن 155 دينار كويتي رودامين المسمى ديكستران الرابع للاحتفال أجري الأوعية الدموية والوقت الفاصل بين التصوير.
عند التصوير الفئران.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
دقة عالية في التصوير الضوئي الجسم الحي بالإضافة إلى العلامات وظيفية fluorescently المسمى مثل البروتينات والأجسام المضادة قد زاد بشكل كبير من فهمنا للتتالي النقيلي. وقد مكن ذلك التصور المباشر وتقدير من وحيدة الخلية والمعلمات الفرعية الخلوية في الخلايا السرطانية والخلايا المضيفة والمكروية بهم. وقد أدى هذا التصوير داخل الورم الرئيسي، على سبيل المثال، إلى اكتشاف microenvironments المنفصلة التي تدعم إما الغزو النمو أو 6،7 نشرها. في حالة الغزو، قد كشفت ف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا البحث من قبل NIH-CA100324 ، P30CA013330 منح دعم مركز السرطان التابع لمعهد أينشتاين الوطني للسرطان ، R01CA172451 إلى JWP وبرنامج التصوير المتكامل. تم تطوير هذه التقنية في مركز Gruss-Lipper Biophotonics وبرنامج التصوير المتكامل في كلية ألبرت أينشتاين للطب. ونحن نقدر دعم هذه المراكز في هذا العمل. يشكر المؤلفون مايك روتنكولبر وريكاردو إيباجون وأنتوني ليجيادرو من متجر ماكينات أينشتاين على حرفيتهم الماهرة وفي الوقت المناسب ، ومختبر ماثيو كروميل لمشاركتهم بسخاء رسومات تصميم النوافذ الخاصة بهم ، وكيفن إليسيري وجيريمي بريدفيلدت لخبرتهم في الفحص المجهري وتوصيات مكبر الصوت وأليسون هارني وبوجانا جليغوريفيتش للمناقشات المفيدة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
منظم شريط مختبر مناديل لاصق محول التنفس الصناعي
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| فراغ نحاسي مطلي بالنيكل 1/8 NPT أنثى ، ث / مقياس ، 0 - 20 "زئبق فراغ | ماكماستر كار | 4172K12 ؛ | منظم الفراغ |
| محول تركيب خرطوم شائكة نحاسي ل 1/4 "معرف خرطوم X 1/8" NPTF ذكر الأنابيب | ماكماستر كار | 5346K13 | محول خرطوم منظم الفراغ قوارير |
| تصفية العلامة التجارية Pyrex مع الأنابيب ؛ الرقبة الأدوات للسدادة المطاطية رقم 4 ؛ السعة: 50 مل | Corning Life Sciences Glass | 5360-50 | قارورة فراغ |
| أغطية زجاجية مستديرة سمك # 1.5 ، 0.16 - 0.19 مم 10 مم قطرة. | تيد بيلا ، إنك. | 260368 | غطاء زلات |
| Exel International Safelet IV القسطرة ؛ 22 جم × 1 بوصة ؛ | قسطرة القصبة الهوائية | Exel International | 26746 |
| خيوط الحرير المضفرة السوداء المضفرة PERMA-Hand ، بكرة الاستغناء عن ETHICON LIGAPAK الحجم 2-0 | VWR | 95056-992 | سلسلة |
| سائل فائق الغراء ، شفاف ، 0.14 أوقية | Hendel Corp. | LOC1647358 | السيانو أكريليت الغراء |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate &ndash ؛ Dextran: | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | 155 kD Dextron |
| Laboratory Clear Tygon PVC Tubing ، 1/16 "ID ، 1/8" OD ، 1/32 "سمك الجدار ، 25 قدما طول | McMaster Carr | 5155T12 | أنابيب رقيقة & أنابيب لأنابيب |
| البولي إيثيلين المقاومة للتشقق ، 1/8 "معرف ، 1/4" OD ، 1/16 "سمك الجدار ، أبيض ، 50 قدما. | ماكماستر كار | 5181K24 | أنابيب سميكة |
| غسول الانكاب | Nair-Micro | ||
| Medical Tubing 95 مقياس التحمل LDPE | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE / 1 | أنبوب لقسطرة وريد الذيل |
| 30 جم × 1 بوصة. BD PrecisionGlide Needle | BD | 305128 | الإبر لقسطرة الوريد الذيل |
| مسحات القطن غير المعقمة Puritan ؛ | فيشر Scientific | 867WCNOGLUE | |
| واضح البولي كربونات الأنبوب الشائكة المناسب ، الحد من المستقيم ل 3/32 "× 1/16" معرف الأنبوب | McMaster Carr | 5117k51 | الموصلات بين الأنابيب |
| سدادات مطاطية ذات ثقب | واحد فيشر Scientific | 14-135F | سدادة لقارورة فراغ |
| نصائح حاجز الدقة SHARP ، ل P-100 ، 100 & micro ؛ ل | دينفيل العلمية. | P1125 | طرف الماصة |
| فيشر Scientific | 159015R | ||
| Puralube | Henry Schein صحة | 008897 | مرهم البصريات |
| طقم الجوزاء كيت كوتيري | جهاز هارفارد | 726067 | قلم الغواء |
| Graefe ملقط تشريح دقيق ؛ مسنن; منحنى طفيف عرض الطرف 0.8 مم ؛ 4 "طول | Roboz الجراحية | RS-5135 | ملقط |
| مقص تشريح دقيق فائق الدقة 4 "مستقيم حاد / حاد 24 مم | Roboz Surgical | RS-5912 | مقص شارب |
| مقص تشريح دقيق 4 "مناديل مقص حادة / حادة | مستقيمة | RS-5980 | مقص حادة |
| فيشر Scientific | 06-666-A & nbsp ؛ | تسخير | |
| نظام PhysioSuite | Kent Scientific | PhysioSuite | Vitals Monitor |
| 1 مل حقنة ، طرف زلة السل | BD | 309659 | حقنة |
| دبابيس | أكريليت السيانو | LOC1647358 | غطاء |
| زلة هلام البترول | فيشر Scientific | 19-086291 | حاجز الماء |
| Luer Cannulla 1.5 - 2.2 مم | جهاز | هارفارد734118 | موصل القسطرة |
| PhysioSuite MouseSTAT مقياس التأكسج النبضي | كينت العلمي | مقياس التأكسج | |
| Isoethesia (الأيزوفلوران) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 مل |
| Oxygen | TechAir | OX TM | |
| 1x PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| PVC الكرة الصمام ، ادفع للتوصيل ، 1/4 في | Grainger | 3CGJ7 | فراغ صمام |
| الحيواني الصغير | هارفارد | جهاز 683 | البديل متاح من كينت علمية: MouseVent |
| OptiMEM مصل مخفض متوسط | ThermoFisher Scientific | 31985062 | |
| ليبوفيكتامين 2000 كاشف الإرسال | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| MacBlue Tg (Csf1r * -GAL4 / VP16 ، UAS-ECFP) 1Hume / J | Mice Jackson Laboratory | 026051 | |
| مجهر متعدد الفوتون | أوليمبوس | فلوفيو FV1000 | بديل لنطاق مخصص |
| الهيكل البيئي | غرفة البلاستيك الدقيقة | ل FV1000 | بديل للحاوية المصممة حسب الطلب |
| الفوسفات المخزنة المحلول الملحي | ThermoFisher العلمي | 14190136 | |
| ليزر الطاقة متر | متماسك | FieldMaxIITOP | |
| رأس مقياس طاقة الليزر | متماسك | PM10 | |
| pcDNA3-Clover ناقل البروتين الفلوري | Addgene | 40259 | |
| G418 كبريتات المضادات الحيوية الانتقائية | ThermoFisher Scientific | 10131027 | |
| MoFlo فارز الخلايا الفلورية | بيكمان كولتر | XDP | |
| التربسين EDTA 1x | كورنينج | 25-052-Cl | |
| 40 & micro; m Mesh | Falcon | 352235 | |
| 96 Well Plate | Costar | 3599 | |
| 60 مم طبق ثقافة | Corning | 430196 | |
| 10 سم طبق ثقافة | Corning | 353003 | |
| مصل الأبقار الألبومين | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1x | Corning | 21-031-CV | |
| C57BL / 6J ماوس | جاكسون المختبر | 000664 | |
| مناديل كيم | فيشر العلمية | 06-666-A |
المراجع
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
