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方法文章

人源细胞中 SCAP N-糖基化及转运分析

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DOI：

10.3791/54709

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2016年11月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, The Ohio State University Comprehensive Cancer Center and College of Medicine

本文内容

摘要

我们介绍了一种改良的人源细胞膜组分分离方法，以及用于检测SCAP N-糖基化和总蛋白的蛋白质印迹（western blot）样品制备方法。此外，我们还引入了一种GFP标记方法，通过共聚焦显微镜监测SCAP的转运过程。本实验方案适用于常规生物学实验室。

摘要

升高的脂质生成是癌症和代谢性疾病的共同特征。固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）是一类膜结合的转录因子家族，可调控胆固醇、脂肪酸和磷脂合成相关基因的表达，在这些疾病中常被上调。在SREBP向细胞核转位的过程中，SREBP裂解激活蛋白（SCAP）在SREBP从内质网（ER）向高尔基体转运及其后续的蛋白水解活化过程中发挥核心作用。近期我们发现，葡萄糖介导的SCAP的N-糖基化是SCAP/SREBP复合物离开内质网并转运至高尔基体的前提条件。N-糖基化可稳定SCAP，并引导SCAP/SREBP的转运。本文介绍了一种从人源细胞中分离膜组分以及制备样品以通过蛋白质印迹法检测SCAP的N-糖基化水平和总蛋白表达的实验方案。此外，我们还提供了一种利用共聚焦显微镜监测SCAP转运的方法。该方案适用于在哺乳动物细胞中研究SCAP的N-糖基化及其转运过程。

引言

脂质代谢失调是癌症和代谢性疾病的共同特征1-6。在这些过程中，固醇调节元件结合蛋白（SREBPs）作为一类转录因子家族，在调控胆固醇、脂肪酸和磷脂的摄取与合成相关基因表达中发挥关键作用7-10。

固醇调节元件结合蛋白（SREBPs），包括 SREBP-1a、SREBP-1c 和 SREBP-2，最初以无活性的前体形式合成，并通过两个跨膜结构域锚定在内质网（ER）膜上7。SREBPs 的 N 端包含一个 DNA 结合结构域，可激活靶基因的转录11。SREBP 前体的 C 端与 SREBP 裂解激活蛋白（SCAP）12,13 结合，SCAP 是一种多通道膜蛋白，在调控 SREBP 的稳定性与活化过程中发挥关键作用14-16。

转录功能的实现需要SCAP/SREBP复合物从内质网（ER）转位至高尔基体，在那里两种蛋白酶依次切割SREBP，释放其N端片段，后者进入细胞核以激活脂质生成相关基因的转录7。在这些过程中，内质网膜中的固醇水平调控SCAP/SREBP复合物从内质网的释放7,17。在高固醇条件下，固醇结合至SCAP或内质网驻留的胰岛素诱导基因蛋白-1（Insig-1）或-2（Insig-2），增强SCAP与Insig蛋白的结合，从而将SCAP/SREBP复合物滞留在内质网中18-20。当固醇水平降低时，SCAP与Insig解离，导致SCAP发生构象改变，使其能够与常见的包被蛋白（COP）II复合物相互作用。该复合物介导SCAP/SREBP复合物进入出芽小泡，并将其从内质网转运至高尔基体21,22。一旦转位至高尔基体，SREBP被Site-1和Site-2蛋白酶依次切割，从而释放其N端片段7,23-29。

SCAP 蛋白在天冬酰胺（N）位点 N263、N590 和 N641 处携带三个 N-连接的寡糖15。我们最近发现，在低固醇条件下，葡萄糖介导的 SCAP 在这些位点的 N-糖基化是 SCAP/SREBP 从内质网转运至高尔基体的前提条件30-32。通过将三个天冬酰胺全部突变为谷氨酰胺（NNN 突变为 QQQ）导致 SCAP 糖基化的丧失，会阻断 SCAP/SREBP 复合物的转运，并引起 SCAP 蛋白的不稳定以及 SREBP 活化水平降低31。我们最近的研究数据还表明，SREBP-1 在胶质母细胞瘤中高度活化，并受 SCAP N-糖基化的调控4,31,33,34。靶向 SCAP/SREBP-1 信号通路正成为治疗恶性肿瘤和代谢综合征的新策略1,3,35-38。因此，建立一种有效的方法来分析 SCAP 蛋白及其 N-糖基化水平，并在人源细胞和患者组织中监测其转运过程具有重要意义。

SCAP 蛋白在内质网中的管腔区（氨基酸 540-707）包含两个 N-糖基化位点（N590 和 N641），当完整膜结构经胰蛋白酶处理时，这两个位点可免受蛋白水解作用15。该管腔片段的分子量约为 30 kDa，足够小，可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分辨出 SCAP 的单个糖基化变异体15,31。本文提供了一种检测人细胞中 SCAP 的 N-糖基化及其总蛋白水平的方法。该方案基于 Brown 和 Goldstein 实验室先前发表的方法15以及我们最近的研究报道31，可用于哺乳动物细胞中 SCAP 蛋白的研究。

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方案

1. 人类细胞中内源性 SCAP 蛋白的检测

  1. 细胞培养与处理
    1. 在10 cm培养皿中接种约 1 × 106 个U87细胞，使用添加5%胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），于37 °C、5% CO2条件下培养24小时后进行处理。
    2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，然后将细胞转入新鲜DMEM培养基中，含或不含葡萄糖（5 mM），继续培养12小时。
  2. 细胞膜组分与核提取物的制备
    1. 用PBS洗涤细胞一次，刮取细胞至1 ml PBS中，在4 °C下以1,000 × g离心5分钟。
    2. 将细胞重悬于冰上预冷的缓冲液中，缓冲液含10 mM HEPES-KOH（pH 7.6）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2、1 mM乙二胺四乙酸钠（EDTA）、1 mM乙二醇双（2-氨基乙基）四乙酸钠（EGTA）、250 mM蔗糖，以及蛋白酶抑制剂混合物（5 µg/ml pepstatin A、10 µg/ml亮抑酶肽、0.5 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、1 mM二硫苏糖醇（DTT）和25 µg/ml N-乙酰-Leu-Leu-Norleu-醛（ALLN）），冰上孵育30分钟。
    3. 将细胞裂解物通过22 G × 1 1/2针头反复推注30次，然后在4 °C下以890 × g离心5分钟以分离细胞核。
    4. 将上清液用于膜组分的分离（步骤1.2.7）。将核沉淀重悬于0.1 ml缓冲液C中（20 mM HEPES/KOH pH 7.6、0.42 M NaCl、2.5%（v/v）甘油、1.5 mM MgCl2、1 mM乙二胺四乙酸钠、1 mM乙二醇双（2-氨基乙基）四乙酸钠，以及蛋白酶抑制剂混合物（5 µg/ml pepstatin A、10 µg/ml亮抑酶肽、0.5 mM PMSF、1 mM DTT和25 µg/ml ALLN））。
    5. 在4 °C下旋转孵育60分钟，然后在微量离心机中于4 °C以20,000 × g离心20分钟。上清液定义为"核提取物"。
    6. 在进行SDS-PAGE前，将核提取物与5×上样缓冲液（312.5 mM Tris-HCl pH 6.8、10% SDS、50%甘油、12.5% β-巯基乙醇和0.05%溴酚蓝）混合，于100 °C加热10分钟。
    7. 将原始890 × g离心所得上清液在4 °C下以20,000 × g再次离心20分钟。为后续进行Western blot分析，将沉淀溶解于0.1 ml SDS裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl pH 6.8、100 mM NaCl、1%（v/v）十二烷基硫酸钠（SDS）、1 mM乙二胺四乙酸钠和1 mM乙二醇双（2-氨基乙基）四乙酸钠）。此组分定义为"膜组分"。
      注：我们采用20,000 × g离心20分钟以沉淀膜组分。布朗和戈德斯坦实验室的文献中曾使用100,000 × g离心10–20分钟15。
    8. 将膜组分在37 °C孵育30分钟，通过Bradford蛋白定量法测定蛋白浓度。在进行SDS-PAGE前，每样品加入1 µl 100×溴酚蓝溶液。
    9. 在10% SDS-PAGE凝胶上每道上样25–50 µg总膜蛋白39。以80 V电泳15分钟，然后改为130 V继续电泳115分钟。以140 mA恒流转膜130分钟39。
      1. 进行Western blot分析时，使用抗SCAP抗体检测总SCAP蛋白。使用内质网驻留蛋白蛋白二硫键异构酶（PDI）40作为内参。使用抗SREBP-1抗体检测SREBP-1的N端条带。使用Lamin A作为核提取物的内参31。

2. 人类细胞中 SCAP N-糖基化的分析

  1. 细胞培养、转染与处理
    1. 用于膜分析时，接种约 1 × 106 在含5% FBS的DMEM培养基中培养10 cm培养皿中的HEK293T细胞，并于37°C、5% CO₂条件下孵育2 转染前培养24小时。
    2. 稀释4 - 8 µg GFP-SCAP质粒（由Peter Espenshade博士惠赠）22 在1 ml低血清培养基中混匀，轻柔操作。
    3. 用移液器将8 - 16 µl DNA转染试剂直接加入含质粒的1 ml低血清培养基中，轻轻混匀。
    4. 室温孵育转染试剂/质粒复合物25分钟。
    5. 将转染复合物加入含有新鲜培养基的细胞中，在5% CO₂条件下继续培养24小时2 和 37 °C。
    6. 用 PBS 洗涤一次，并在有或无葡萄糖（5 mM）的条件下培养细胞 12 小时，同时加入或不加入衣霉素（1 µg/ml），一种 N-糖基化抑制剂
  2. 按照步骤 1.2.1、1.2.2、1.2.3 和 1.2.7 所述制备细胞膜沉淀。
  3. SCAP 的检测 N-糖基化
    1. 胰蛋白酶消化
      1. 将过表达GFP-SCAP的细胞的膜沉淀重悬于114 µl含有10 mM HEPES·KOH（pH 7.4）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl₂的缓冲液中2，1 mM 柠檬酸钠，100 mM NaCl。
      2. 在30 °C下孵育57 µl膜蛋白样品，每份样品中加入或不加入1 µl胰蛋白酶（1 µg/µl），总体积为58 µl，孵育时间为30分钟。
      3. 通过加入 2 µl（400 单位）大豆胰蛋白酶抑制剂终止反应。
    2. 通过肽的去糖基化N-糖苷酶F（PNGase F）
      1. 为后续使用PNGase F处理，向每个样品中加入10 µl含有3.5%（wt/vol）SDS和7%（vol/vol）2-巯基乙醇的溶液。
      2. 加热至100 °C持续10分钟后，依次加入7 µl 0.5 M磷酸钠（pH 7.5）、7 µl 10% (v/v) Nonidet P-40（含12×蛋白酶抑制剂）和2 µl（0.5 U/µl）PNGase F。
      3. 37 °C孵育3小时后，加入5倍上样缓冲液（312.5 mM Tris-HCl pH 6.8，10% SDS，50%甘油，12.5% β-巯基乙醇和0.05%溴酚蓝）终止反应。将混合物在100 °C加热10分钟，进行SDS-PAGE分析。每泳道上样25–50 µg总膜蛋白至10% SDS-PAGE凝胶中。39以80 V电泳15分钟，然后调至130 V继续电泳115分钟。以140 mA转膜130分钟。
      4. 对于 Western 印迹，使用 10 µg/ml 抗 SCAP（9D5）抗体进行检测 N-糖基化及总SCAP蛋白

3. 利用人源细胞中的GFP-SCAP检测SCAP从内质网到高尔基体的转运

  1. 在60 mm培养皿中接种2.5 × 105个U87细胞，使用添加5% FBS的DMEM培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养24小时，然后进行转染。
  2. 将4 µg GFP-SCAP质粒溶于0.5 ml低血清培养基中并混匀。
  3. 用移液器将8 µl DNA转染试剂直接加入含有质粒的0.5 ml低血清培养基中，轻轻混匀。
  4. 在室温下孵育转染试剂/质粒复合物25分钟。
  5. 将转染复合物加入含新鲜培养基的细胞中，在5% CO2、37 °C条件下继续培养24小时。
  6. 将5 - 10 × 104个细胞重新接种至含有玻璃盖玻片（22 mm × 22 mm）的6孔板中，在37 °C、5% CO2条件下继续培养24小时。
  7. 用PBS洗涤一次，然后在有或无葡萄糖（5 mM）的条件下处理细胞12小时，同时可选择是否加入衣霉素（1 µg/ml）。
  8. 用PBS洗涤一次，再用4%多聚甲醛固定10分钟。
  9. 用PBS洗涤细胞三次，将盖玻片倒置，与抗荧光淬灭试剂一起封片于载玻片上，并用指甲油封边。
  10. 使用激光共聚焦显微镜的63X油镜观察GFP-SCAP的转运情况41。

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结果


图1显示了通过蛋白质印迹法检测葡萄糖刺激下人胶质母细胞瘤U87细胞中内源性SCAP蛋白和SREBP-1核形式的表达情况。膜蛋白SCAP在“膜组分”中被检测到，而SREBP-1的核形式（N端）则在“核提取物”中被检测到。葡萄糖刺激显著增强了SCAP蛋白水平（PDI作为内质网膜蛋白的内参对照）以及SREBP-1核形式的表达。这些结果表明，该实验方案能够有效检测人细胞中的内源性SCAP蛋白。


图2 显示对SCAP的分析 N-糖基化及总GFP-SCAP蛋白水平在表达GFP标记的仓鼠SCAP的HEK293T细胞中对葡萄糖刺激和衣霉素处理的响应 图 2A 显示SCAP蛋白在内质网膜上的主题结构，跨越膜并携带三个 N-糖基化位点。位于第6个跨膜区的SCAP片段，包含氨基酸540...

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讨论

本研究中，我们描述了一种从人细胞中分离膜组分以及制备样品以通过蛋白质印迹法检测SCAP N-糖基化和总蛋白的实验方案。此外，我们还提供了一种利用GFP标记和共聚焦显微镜监测SCAP转运的方法。该方法专门用于分析膜蛋白，是研究SCAP N-糖基化及其转运过程的重要工具。

与利用多种凝集素识别不同N-聚糖链并鉴定N-糖基化蛋白的方法42相比，本文所述方法采用PNGase F去除蛋白连接的N-聚糖，并通过检测迁移率变化来鉴定SCAP蛋白片段（氨基酸540-707）的糖基化状态。凝集素方法的局限性在于依赖于选择合适的凝集素以识别特定类型的N-聚糖。而我们的PNGase F酶切方法为分析SCAP的N-糖基化提供了一种简便的实验流程。此外，该方法还可应用于均质化后的人类患者样本或动物组织中SCAP的N-糖基化状态及蛋白水平的分析2。本研究提供了一种新的工具，可用于分析癌症和代谢性疾病中脂质代谢的特征。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Mike S. Brown 博士和 Joseph L. Goldstein 博士同意按照其已发表文献中所述方法发布本方法。我们感谢 Peter Espenshade 博士分享 GFP-SCAP 质粒。本研究由 NIH 基金 NS072838 和 NS079701（资助对象：D.G.）、美国癌症协会研究学者基金 RSG-14-228-01-CSM（资助对象：D.G.）以及 OSUCCC Pelotonia 博士后奖学金（资助对象：C.C.）提供支持。我们还感谢俄亥俄州立大学神经科学核心设施（P30 NS038526）以及 OSUCCC 转化治疗项目种子基金和启动资金对 D.G. 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
X-treme GENE HP DNA 转染试剂Roche6366236001
Opti-MEMI 培养基Life Technologies31985-070
trypsin SigmaT6567
大豆胰蛋白酶抑制剂SigmaT9777
PNGase F SigmaP7367
抗 SCAP 抗体 (9D5)  Santa Cruzsc-13553
GFP 抗体 Roche11814460001
SREBP-1 抗体 (IgG-2A4)BD Pharmingen557036
PDI 抗体 (H-17)Santa Cruzsc-30932
Lamin A 抗体 (H-102)Santa Cruzsc-20680
SCAP 抗体 (a.a 450-500)Bethyl Laboratories, Inc.A303-554A
不含葡萄糖、丙酮酸和谷氨酰胺的 Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 (DMEM)  Cellgro17-207-CV使用前添加 1 mM 丙酮酸和 4 mM 谷氨酰胺
22 G × 1 1/2 针头BD305156
胃蛋白酶抑制剂 ASigmaP5318
亮抑蛋白酶肽SigmaL2884
PMSFSigmaP7626
DTTSigma43819
ALLNSigmaA6185
硝酸纤维素膜GERPN3032D
EDTA 溶液 0.5 M pH 8.5 100 mlVWR82023-102
EGTA 0.5 M 无菌 (pH 8.0) 50 mlFisher Scentific50255956
HyClone FBSThermo scientificSH3007103
甘油SigmaG5516
β-巯基乙醇 SigmaM3148
溴酚蓝SigmaB8026
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭试剂Life TechnologiesP36935
L-谷氨酰胺 (200 mM)Life Technologies25030081
丙酮酸钠Life Technologies11360-070

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