aritmie cardiache ereditarie sono spesso causate da mutazioni che alterano la consegna di superficie di uno o più canali ionici. Qui, ci adattiamo citometria a flusso saggi di fornire una quantificazione della espressione proteica totale e superficie cellulare relativa dei canali ionici ricombinanti espressi in TSA-201 cellule.
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Articolo metodologico
Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le mutazioni ereditarie o de novo nei canali cationico-selettivi possono portare alla morte cardiaca improvvisa. Spesso si ipotizza che l'alterazione del traffico di membrana plasmatica di queste proteine transmembrana multi-spanning, con o senza cambiamento nel gating del canale, contribuisca in modo significativo a questo processo. È quindi diventato fondamentale sviluppare un metodo per quantificare il cambiamento dell'espressione relativa della superficie cellulare dei canali ionici cardiaci su larga scala. In questo articolo, viene fornito un protocollo dettagliato per determinare l'espressione relativa totale e della superficie cellulare dei canali del calcio cardiaci di tipo L CaV1.2 e delle subunità associate alla membrana nelle cellule tsA-201 utilizzando saggi di citometria fluorescente a due colori. Rispetto ad altri metodi qualitativi basati sulla microscopia o sull'immunoblotting, gli esperimenti di citometria a flusso sono saggi veloci, riproducibili e di grande volume che forniscono endpoint quantificabili su grandi campioni di cellule vive (che vanno da 104 a 106 cellule) con caratteristiche cellulari simili in un unico flusso. I costrutti sono stati progettati per esprimere costitutivamente mCherry al C-terminale intracellulare (consentendo così una rapida valutazione dell'espressione proteica totale) ed esprimere un epitopo di emoagglutinina (HA) rivolto verso l'extracellula per stimare l'espressione della superficie cellulare delle proteine di membrana utilizzando un anticorpo coniugato a fluorescenza anti-HA. Per evitare falsi negativi, sono stati condotti esperimenti anche su cellule permeabilizzate per confermare l'accessibilità e la corretta espressione dell'epitopo HA. La procedura dettagliata prevede: (1) progettazione di costrutti di DNA marcati (acido desossiribonucleico), (2) trasfezione lipidica-mediata di costrutti in cellule tsA-201, (3) coltura, raccolta e colorazione di cellule non permeabilizzate e permeabilizzate e (4) acquisizione e analisi di segnali fluorescenti. Inoltre, vengono spiegati i principi di base della citometria a flusso e viene discusso in modo approfondito il disegno sperimentale, compresa la scelta dei fluorofori, la titolazione dell'anticorpo HA e gli esperimenti di controllo. Questo approccio specifico offre una quantificazione relativa oggettiva dell'espressione totale e della superficie cellulare dei canali ionici che può essere estesa allo studio delle pompe ioniche e dei trasportatori di membrane plasmatiche.
Introduzione
Questo documento fornisce un test affidabile per segnalare il relativo espressione superficie cellulare di proteine di membrana, quali canali ionici espressi in cellule ricombinanti utilizzando la tecnologia di citometria a flusso esistente. I canali ionici sono proteine di membrana che formano pori che sono responsabili del controllo segnali elettrici dal gating il flusso di ioni attraverso la membrana cellulare. Essi sono classificati dal meccanismo di attivazione, la natura e la selettività di specie ioniche in transito attraverso il poro dove sono localizzate. A livello cellulare e dei tessuti, i flussi ionici macroscopici attraverso i canali ionici sono il p....
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Protocollo
1. costrutti Doppiamente Tagged DNA
- Inserire l'epitopo HA (YPYDVPDYA) nel linker extracellulare di Ca V α2δ1 tra D676 e R677 per mutagenesi sito-specifica (figura 3B) 20. Utilizzare gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC Forward primer e Reverse acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC primer.
- Subclone la sequenza cDNA della targhetta V α2δ1 HA Ca nel vettore di espressione di mammifero pmCherry-N1 progettato per esprimere la proteina fusa all'N-terminale di mCherry tra i siti SacI e Sali (Figura 3B) 20.
NOTA: La funzione di canale appropriato deve essere ....
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Risultati
Questo articolo descrive un protocollo affidabile per quantificare la superficie totale e delle cellule dei canali ionici ricombinanti espressi in TSA-201cells da un flusso a due colori citometria a test. Come esempio, la superficie di cella relativa e l'espressione di proteine totali è stata quantificata per il V α2δ1subunit Ca. Per eseguire il flusso a due colori citometria assay, Ca V α2δ1 stato doppiamente etichettato esprimere un HA epitopo non fluorescente.......
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Discussione
Questo test citometria a base di flusso è stato applicato con successo per la misurazione dei livelli relativi totale e superficie cellulare di subunità fluorescenza marcata formano pori e associati dei canali del calcio voltaggio-dipendenti 14,22,26. Si è utilizzato al meglio quando si indaga l'impatto di mutazioni genetiche e richiede quindi che l'intensità di fluorescenza intrinseca del wild-type costrutto fluorescenza marcata tag essere di almeno 10 a 100 volte più grande per l'intensità di fl.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Sig. Serge Sénéchal e il Dr. Jacques Thibodeau per aver condiviso la loro esperienza e averci concesso l'accesso alla loro piattaforma di citometria a flusso e di smistamento cellulare. Questo lavoro è stato completato con la sovvenzione operativa 130256 dal Canadian Institutes of Health Research, una sovvenzione in aiuto dalla Canadian Heart and Stroke Foundation e il sostegno della "Fondation de l'Institut de Cardiologie de Montréal" a L.P.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Q5 Kit per mutagenesi sito-diretta | New England Biolabs | E0554S | Può essere sostituito con il kit per mutagenesi sito-diretta QuickChange (Agilent, #200523). |
| Tubi 1,5 ml | Sarstedt | 72-690-001 | |
| Tubi 15 ml | Sarstedt | 62-554-002 | |
| Pipette graduate monouso per trasferimento | VWR | 160001-192 | |
| Piatto di coltura da 100 mm | Corning | 430167 | Per la coltura standard di cellule HEKT. |
| Piatto di coltura da 35 mm | Falcon | 353001 | Per la coltura standard di cellule HEKT. |
| Pipetta sierologica 1 ml | Sarstedt | 86.1251.001 | |
| Pipetta sierologica 5 ml | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Pipetta sierologica 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Pipetta sierologica 25 ml | Sarstedt | 86.1285.001 | |
| Mezzo ad alto glucosio di Dulbecco | Technologies | 12100-046 | Warm in 37 & Deg; C bagnomaria prima dell'uso. |
| Siero fetale bovino, qualificato, inattivato a caldo, origine statunitense | Life Technologies | 16140-071 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Lipofectamina 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Per la trasfezione liposomiale. Può essere sostituito con trasfezione di fosfato di calcio. |
| Opti-MEM I Siero Ridotto Medium | Life Technologies | 31985-070 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso. |
| Tripsina-EDTA (1x) 0,05%, rosso fenolo | Life Technologies | 25300-062 | |
| microprovette da 1,5 ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato 1x | Fisher | BP661-10 | Può essere "fatto in casa". |
| Anticorpo coniugato anti-HA FITC | Sigma | H7411 | |
| IgG1− FITC Anticorpo per il controllo dell'isotipo | Sigma | F6397 | |
| BD Kit di soluzioni per fissazione/permeabilizzazione Cytofix/Cytoperm BD | Biosciences | 554714 | Fissazione/permeabilizzazione. Permeabilizzazione/Soluzione di lavaggio, conservare a 4 °C. |
| Ematocitometro | Fisher | 49105161 | |
| Trypan Blue | Fisher | 15250061 | Per accedere alla vitalità cellulare. |
| Microcentrifuga refrigerata, 5430R | Eppendorf | ||
| Incubatore Forma Steri-Cycle CO2 | Fisher | 370 | |
| Piattaforma da laboratorio Rocker | Fisher | 545034 | |
| Bagno d'acqua | VWR | 89032-216 | |
| BD FACSARIA III | BD Biosciences | 648282 | Citometro a flusso. |
| FlowJo Software v10 | FlowJo | FlowJo v10 Dongle | Per l'analisi dei dati. |
Riferimenti
- Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
- Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defec....
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Ristampe e permessi
