Возпроизводимо Артериальная Денудация Травма от ИНФРАРЕНАЛЬНОГО брюшного отдела аорты зажимное в мышиной модели

Краткое содержание

Понимание клеточных и молекулярных механизмов повторного эндотелизации после повреждения артерии денудационного имеет первостепенное значение для профилактики тромбоза и рестеноза артерий. Здесь мы опишем протокол для воспроизводимой артериальной денудационного травмы инфраренального брюшной аорты. Процедура была разработана, чтобы исследовать основные механизмы, которые регулируют эндотелиальную регенерацию с использованием модели мыши.

Аннотация

Чрескожная сосудистых вмешательств равномерно приводят к артериальной денудационными травм, которые впоследствии приводят к тромбозу и рестеноз. Эти осложнения могут быть отнесены к ухудшений в повторной эндотелизации в пределах краев раны. Тем не менее, клеточные и молекулярные механизмы повторной эндотелизации еще предстоит определить. В то время как несколько моделей на животных для изучения повторного эндотелиализацию после артериальной денудации доступны, некоторые из них выполнены в мыши из-за хирургических ограничений. Это подрывает возможность использовать трансгенные линии мышей и исследовать вклад специфических генов в процессе повторного эндотелизации. Здесь мы приводим протокол шаг за шагом для создания хорошо воспроизводимый мышиной модели повреждения артерии денудационного в инфраренального брюшной аорты с использованием внешнего сосудистого зажима. Иммуноцитохимическая окрашивания поврежденных аорте для фибриногена и бета-катенина демонстрируют экспозицию про-тромботические поверхностью соd границу неповрежденного эндотелия, соответственно. Изложенный здесь метод имеет преимущества скорости, отличной общей выживаемости, а также относительной технической простотой, создавая уникальный практический инструмент для наложения артериальной травмы денудации в трансгенных мышах. С помощью этого метода исследователи могут пролить свет на механизмы повторного эндотелизации при нормальных или патологических состояниях.

Введение

Тромбоз и рестеноз серьезные ранние и поздние осложнения у пациентов , которые подвергаются подкожных сосудистых вмешательств, таких как эндоваскулярной баллонной ангиопластики и стентирования ^1,2. Существует несколько стратегий были использованы для устранения этих осложнений, в частности двойной антитромбоцитарной терапии и стенты с лекарственным покрытием. Тем не менее, мало внимания было уделено основной причиной тромбоза и рестеноза, а именно потери покрытия эндотелиальных клеток (денудации). травмы Денудация является неизбежным следствием интервенционных процедур вследствие механической травмы стенки кровеносных сосудов. Эта механическая травма может привести к повреждению и снятия защитного слоя эндотелиальной и воздействия базальной мембраны и гладкой мускулатуры сосудов к циркулирующей крови ^3. Потеря эндотелиальных клеток в этих областях создает про-тромботические и провоспалительных среду, которая не только способствует адгезии тромбоцитов и последующий тромбоз, ноLSO стимулирует миграцию и пролиферацию клеток гладких мышц сосудов , приводящих к утолщению неоинтимы и рестеноза ^4. Эти осложнения, и связанные с ними методы лечения, приводят к значительной заболеваемости, особенно рецидивирующей ишемической болезни и кровотечения событий, оказывающих вредное воздействие на здоровье человека.

Re-эндотелиализацию обнаженную травмы от краев раны имеет первостепенное значение для профилактики тромбоза и рестеноза ^5. Вскрытие результаты и модели на животных продемонстрировали , эффективно применение пониженных ставок тромбоза с охватом стента распорки ^6,7. Стенты с лекарственным покрытием, разработанный для уменьшения скорости рестеноза путем ингибирования пролиферации гладких мышц и гиперплазию неоинтимы, приводят к значительным нарушениями в артериальной ре-эндотелизации и возрастающих темпов поздних тромбозов ^3. К сожалению, понимание механизмов для повторного эндотелизации был медленный процесс, в значительной степени ограничен отсутствием армодели на животных. ⁸ щих образовательных

Существует несколько моделей на животных для понимания роли эндотелиальных клеток и клеток гладкой мускулатуры сосудов после повреждения артерии были созданы ^7,9,10. Крыса сонной артерии на воздушном шаре модель травмы лучше характеризует и был использован для изучения влияния травмы денудационного на валовой, клеточном и молекулярном уровне ^11. Тем не менее, хорошо воспроизводимым мышиной модели повреждения артерий денудационного с отличной выживаемости не хватает, и многое необходимо использовать несколько трансгенных линий, доступных, чтобы лучше выяснить регенерацию сосудов в различных условиях.

Эта рукопись представляет собой мышиную модель повреждения артерий денудации, что воспроизводим и прост в исполнении. Подход показал минимальную заболеваемость и смертность в нескольких трансгенных линий. Из-за широкого ряда генетически модифицированных линий мышей, эта модель может быть использована длявыяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе повторной эндотелиализацию после травмы денудации.

Протокол

Примечание: Этот протокол был одобрен Исследовательским комитетом животного происхождения в Университете Калифорнии в Лос-Анджелесе.

1. предоперационной подготовки и анестезиологии

1. Обязательно соблюдайте стерильность в течение всей процедуры.
2. Стерилизовать всех хирургических расходных материалов с помощью паровой автоклав.
3. Включите нагреваемой с грызунами хирургической платформы до индукции анестезии, так что она может нагреваться до соответствующей температуры (37 ° C) и место под стереомикроскопа для визуализации во время хирургической процедуры.
4. Место мыши в анестезии индукции камеры и индуцируют с 4% изофлуран при скорости потока 1 л / мин.
   1. Тщательно контролировать частоту дыхания и подушечку цвет кожи мыши во время индукции.
   2. После того, как замедление частоты дыхания, удалить мышь из индукции камеры и поместите на подогретое площадку для хирургической подготовки с лицом в отдельном и головная часть поддерживающей концентрации изофлуран 2,5%.
   3. Выполните носок щепотку для оценки адекватности наркоза.
5. Применение глазной мази на роговицу и управлять предоперационной карпрофен (5 мг / кг) подкожно.
6. Поместите мышь лежа на спине и использовать кусачки для удаления волос из брюшной полости.
7. Подготовьте хирургическую область с тремя чередующимися скрабы повидона йода и 70% изопропилового спирта применяются стерильными марлевыми подушечками.
8. Место лежа на спине мыши на нагретом грызунами хирургической платформы с лицом в головная часть и зафиксировать все конечности и тщательно положение мыши таким образом, что живот виден с стереомикроскопа.
9. Поместите стерильные, липких повязок вдоль каждого края подготовленной хирургической области.
10. Titrate изофлуран концентрации для поддержания адекватной анестезии во время операции, сохраняя при этом спонтанных дыханий.

2. ИНФРАРЕНАЛЬНОГО аортального Зажимая

1. Сделать 3 см надрез вниз по средней линии живота с помощью скальпеля, начиная approximatelу 0,5 см уступает мечевидного отростка.
2. Аккуратно втяните кожу пинцетом и рассекают кожу от брюшной стенки с помощью тонких ножниц, чтобы разрезать тонкую соединительную ткань.
3. Применяют 0,05-0,1 мл 0,5% бупивакаина к мышечной стенке и сделать 2 см разрез в брюшной стенке, чтобы подвергать органы брюшной полости.
   1. Если кровотечение происходит вдоль брюшной стенки, применять мягкое давление с ватным наконечником аппликатором.
4. Аккуратно поднимите кишечник с помощью солевых пропитанной ватным наконечником аппликаторы.
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать тупой травмы тощей и подвздошной артерии и место на теплом, пропитанной стерильным физиологическим марлевую губкой вне брюшной полости.
   1. Накройте кишечник с другой теплой, стерильного физиологического раствора пропитанной марли губкой, чтобы избежать потери влаги.
5. Поместите втягивающего lateralize в прямую кишку и разоблачить забрюшинного пространства.
6. Поместите небольшие марлевые тампоны по мере необходимости для визуализации retroperitoneгм отслеживания числа используемых.
7. На уровне нижнего полюса правой почки, используйте острые препаровальный пинцет, чтобы сделать retroperitonotomy латерально по отношению к аорте.
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы не повредить нижнюю полую вену или окружающие сосуды.
   1. Попросту рассекать ткани забрюшинного от аорты стараясь не проколоть нижнюю полую вену или окружающую сосудистую сеть.
8. Поместите сосудистый зажим над аортой в течение по крайней мере 1 мин или другого определенного времени, и проверить окклюзию путем визуального наблюдения отсутствие пульсации в дистальной аорты.
9. Удалите сосудистый зажим и проверьте гемостаз. Гемостаз достигается и обеспечивается при отсутствии активного экстравазации крови не видно.
   1. Подтвердите кровоизлияние путем добавления 0,5 мл физиологического раствора в брюшной полости и оценки, если солевой раствор становится все более кровянистые. Если дело обстоит именно так, применять мягкое давление с использованием физиологического раствора пропитанной аппликатор в течение 1 мин, чтобы обеспечитьгемостаз.
10. Удалите все марлевые тампоны , помещенные , чтобы помочь в визуализации забрюшинного пространства и заменить кишок на месте в брюшной полости.
11. Промывать брюшной полости с помощью подогретого стерильного физиологического раствора.

3. Закрытие лапаротомии и кожи

1. Закройте брюшной стенки слой мышц с использованием 5-0 плетеный, поглощаемый запущенную швом.
2. Закрыть кожи с 1-3 каплями полимерного клея и затем последовательно с заживлением зажимами, как только клей установлен.

4. Восстановление и оценка Послеоперационный

1. Перенесите мышь в клетку восстановления на грелку с пищей и водой на полу клетки.
2. Внимательно следить за мышь для выявления признаков дыхательной недостаточности. Администрирование карпрофен (5 мг / кг) ежедневно в течение 48 часов после операции согласно требованиям учреждения.
   1. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины recumbency.
3. Вернуть мышь к нормальной клетке с пищей и водой.
   1. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью не выздоровел.
4. Оценка раны на ежедневной основе для зияние и снимать клипы на день после операции 14.

5. аортального Вскрытие и Окрашивание

1. Выбор мышей в жертву основано на определенный момент времени интерес после повреждения денудационного.
2. Жертвоприношение мышей с помощью изофлуран ингаляции и сразу же вводят с 5 мг хлорида метахолину , чтобы привести к сосудистой релаксации гладкой мускулатуры.
3. После подтверждения смерти от респираторной прекращения, отсутствие рефлекса роговицы и отсутствие движения, обрызгивать 4% параформальдегидом в фосфатном буферном солевом растворе при давлении перфузии 100 мм рт.ст. через левый желудочек сердца в течение 10 мин.
4. Используйте рассекает стереомикроскопа тщательно отделить неповрежденную брюшной аорты отокружающие ткани.
5. Трансекте аорты ростральнее почечных артерий и каудально по отношению к подвздошной бифуркацией и открыл с помощью продольного разреза вдоль спинной поверхности.
6. Закрепление аорту плашмя на блюде 35 мм с силиконовым покрытием с полостной стороной вверх для фиксации в течение не менее 2 часов, но не более 12 часов. Затем ткань может быть либо встроен для секционирования или использовать в анфас целом монтажа иммуноцитохимию.
7. Гора окрашивали с просвету аорты стороне, обращенной к покровное на стеклах для конфокальной микроскопии.

Результаты

Восемьдесят пять мышей подверглись выживания хирургической техники, описанной в настоящем докладе для инфраренального брюшной аорты зажима. Общая выживаемость составила 85,9%. Оперативные осложнения включали кишечное кровотечение и большую перфорацию сосудов, что приводит к 5,9% и 3,5% соответственно смертности (таблица 1). После выхода из наркоза, мыши нормально ходить и не проявляют никаких признаков ишемического повреждения нижних конечностей. Не было отмечено снижени...

Обсуждение

Артериальное травма оголение вследствие чрескожных вмешательств, таких как баллонной ангиопластики и стентирования сосудов, приводит к ранней и поздней тромбоза сосудов и рестеноза и способствует повторных ишемических событий ^3,12. Интересно, что хирургическое сосудистая зажимное также участвует в качестве причины артериальной денудации, расширение масштабов этой проблемы для пациентов , перенесших любую сосудистую процедуру, будь то чрескожной или открыть ^13. В то время как нарушенная повторно энд...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Zeiss Discovery.V12 Стереомикроскоп	Zeiss	495037-9904-000
Хирургическая платформа с подогревом для грызунов	Protech International	RES4000	Платформа с подогревом для поддержания температуры тела с носовым конусом для поддержания анестезии и на которой проводится хирургическая процедура
Изофлуран	Henry Schein	50033	4% индукция; 2,5% поддерживающая
изофлуран Испаритель	Summit Медицинское оборудование	470062
Stryker T/Pump Рециркулятор теплой воды	Kent Scientific	TP-700
Искусственные слезы Смазка Офтальмологическая мазь	Akorn Animal Health	17478-162-35
Carprieve (Carprofen)	Norbrook Laboratories	NDC 55529-131-01
Oster™ Профессиональная машинка для стрижки животных A5	M.Schneider & Сыновья Инк.	78005010	Используйте с машинкой для стрижки животных размера 40
Регулируемая проволочная втягивающая	способность Fine Science Tools	17004-05
Schwartz Micro Serrefines - Острый изгиб	Fine  Science Tools	18052-03
Хирургические инструменты	Fine Science Tools		острые рассекающие щипцы, тупые щипцы, тонкие ножницы, пружинные ножницы, гемостат
0,5% Marcaine	Hospira	0409-1610-50
5-0 Шовный материал, Vicryl	Fisher Scientific	NC0189890	коническая игла
Vetbond	Fisher Scientific	NC0304169
Falcon® 35 мм Не обработанная TC Легкая для захвата бактериологическая чашка Петри	Corning	351008
Sylgard 184 Набор силиконовых эластомеров	Dow Corning	3097358-1004
Препарирующие штифты	Fisher Scientific	NC9681411