Необходимы новые методы выделения первичных эндотелиальных клеток из кровеносных сосудов. Этот протокол описывает новую методику, которая полностью инвертирует интересующие кровеносные сосуды, подвергая ферментативному перевариванию только эндотелиальную сторону. Полученная культура чистых эндотелиальных клеток может быть использована для изучения сердечно-сосудистых заболеваний, моделирования заболеваний и ангиогенеза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сердечно-сосудистые заболевания изучаются как в медицине, так и в ветеринарии. Эндотелиальные клетки широко использовались в качестве модели in vitro для изучения васкулогенеза, ангиогенеза (опухоли) и атеросклероза. В настоящее время стандартом для исследований in vitro эндотелиальных клеток человека (ЭК) является использование эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) и эндотелиальных клеток пупочной артерии человека (HUAEC). Для исследования эндотелия у собак доступна только одна клеточная линия (CnAOEC), которая получена из эндотелия аорты собак. Хотя в настоящее время это не совсем понятно, существует разница между ЭК, происходящими из артерий или вен. Для более непосредственного подхода к исследованиям функциональности ЭК in vitro мы описываем новый метод выделения первичных эндотелиальных клеток собак (CaPEC) из различных сосудов. Этот метод снижает вероятность контаминации быстрорастущими клетками, такими как фибробласты и гладкомышечные клетки, проблема, которая распространена при стандартных методах выделения, таких как промывание сосуда ферментативными растворами или измельчение сосуда перед перевариванием ткани, содержащей все клетки. Метод, который мы описываем, был оптимизирован для собачьей модели, но может быть легко использован для других видов, таких как человек.
Введение
Собаки используются в качестве большой животной модели для исследования сердечно - сосудистых заболеваний , а также может страдать от врожденных (генетических) сосудистых аномалий 1, 2. Для изучения этих болезней коммерческие клеточные линии эндотелиальные часто используются для оценки эндотелиальных клеток (EC) функциональные возможности . Для собак есть одна коммерческая линия эндотелиальные клетки доступны (CnAOEC), полученный из собачьей аорты. Эта клеточная линия в основном используется в исследованиях в качестве контроля нормального Écs 3-5. В исследовании сердечно-сосудистой системы человека наиболее часто используемые клеточные линии энд....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этика заявление: Кровеносные сосуды, используемые в данном исследовании, собирают способом, получают из свежих собачьих кадавров излишков материала (N = 4) от здоровых собак эвтаназии для неродственных исследований (политики университета 3R). Аберрантных кровеносных сосудов (внутри- и внепеченочных портосистемные шунты, п = 1 каждая) собирали посмертного после информированного согласия владельцев от собак, представленных в университетской клинике для домашних животных из Утрехтского университета.
1. Выделение и культуры первичных Собачий эндотелиальных клеток
- Предварительное покрытие 6-луночные планшеты с 2 мл / лунку 0,5% вес ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Различные кровеносные сосуды были успешно подвергнуты описанному протоколу изоляции (рисунок 2). Можно было препарировать и инвертировать аорта, полая вена, полую и Порта, коронарной артерии от здоровых собак (все сосуды от каждой собаки, п = 4). С того же подхода КЭ были выделены из двух врожденных портосистемные шунты (внепеченочных и внутрипеченочных, п = 1 каждый). Хотя аорту легко инвертировать, грудные сегменты аорты более сложной, чем брюшной аорты. В грудных сегм.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В исследованиях , посвященных собачьего КЭ основной линии CnAOEC используется для моделирования эндотелиальные родословных собаки 3, 12, 13. В исследованиях на людях, культуре HUVEC по - прежнему считается золотым стандартом. Очевидно, ориентируясь только на КЧС, полученных из пуповины является фирма ограничение в сердечно-сосудистых исследований. Эндотелиальные клетки имеют специфический характер экспрессии генов, определяющий артериовенозной спецификации. Для того, чтобы учесть эти различия в послеродовых с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Авторы выражают признательность Хансу де Граафу и Томасу Венендалю за их техническую помощь в культивировании ЭК.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Коллагеназа типа II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Сбалансированный солевой раствор Хэнка Life | Technologies | 14025-050 | |
| Среда для роста эндотелиальных клеток собак | Клеточное применение | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Клеточное применение | Cn304-05 | |
| Фетальная сыворотка теленка (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| Набор для синтеза iScript | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR зеленая суперсмесь | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Среда для замораживания клеток | восстановления Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Держите на льду перед использованием |
| Контейнер для заморозки, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Желатин | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Хирургические ножницы (Майо или Метценбаум) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Москитные щипцы | B. Braun Medical | FB440R | |
| Щипцы от комаров изогнутые | B. Braun Medical | FB441R | |
| полиглактин 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| трипановый синий | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Автоматизированная счетная камера | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Счетные стекла, двухкамерные | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Медленное оттаивание на льду |
| &-микро-горка Ангиогенез | Ibidi | 81501 | |
| Эндотелиальный рост Среда | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Лонза | СС-4176 |
Ссылки
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
