이 절차는 아스피린-푸마르산염 전구약물의 항-NFκB 및 항암 줄기세포 활성을 합성하고 특성화하는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
염증 전이에 암 발생 및 홍보, 결국 진행의 기초가 암의 특징이다. 따라서, 표준 암 연대에 소염제를 추가하는 것은 환자의 결과를 향상시킬 수있다. 그러한 약물 아스피린 (아세틸 살리실산, ASA)은, 암 화학 예방법 및 항 종양 활성에 대해 탐구되었다. 시클로 옥 시게나 제 2 축 프로스타글란딘 억제 외에 ASA의 항암 활동은 핵 인자 ĸB (NFĸB) 억제에 기인하고있다. ASA 장시간 사용이 위장관 독성을 유발할 수 있기 때문에, 프로 드럭 전략이 성공적으로 구현되었다. 이 전구 약물에 ASA의 카르 복실 산 마스크 추가 약물 조제가 통합되어 설계.
이 프로토콜은 우리가 아스피린 푸마르산 전구 약물 GTCpFE 합성 및 유방암 세포에서 NFĸB 경로의 억제를 그 특징으로하며 암의 감쇠 줄기 등 적절한 방법을 설명넥타이, 중요한 NFĸB 의존 표현형. ASA는 ASA 구조에 추가 푸마 상당히 활성에 기여하고 있음을 나타내는 임의의 억제 활성이 결여 반면 GTCpFE 효과적으로 유방암 세포주에서 NFĸB 경로를 억제한다. 면역 표현형 - 또한, GTCpFE는 mammosphere 형성을 차단하고 암 줄기 세포 관련 CD44 + CD24를 감쇠에 의해 상당한 항암 줄기 세포의 활동을 보여줍니다. 이들 결과는 화학적 예방 및 암 치료를위한 개선 된 항 - 염증 약물의 개발이 가능한 전략을 수립.
서론
염증은 전이 1 입사 및 승진, 결국 진행으로 종양의 여러 측면을, 기초가 품질 증명이다. 유방암이 더욱 전이 및 재발 모두 유방암 발병률 감소, 위험과 연관된다 (살리실산, ASA 아세틸) 고전적인 비 스테로이드 성 항 염증 약물 아스피린의 일정한 사용을 나타내는 역학 관측에 의해지지된다 2,3. ASA 주로 종종 유방암 4,5-에서 상향 조절된다 사이클로 옥 시게나 제 -2 활성을 억제함으로써 작용한다. 그러나, ASA의 항암 효과는 비정상적인 핵 인자 κB (NFκB) 6-8 시그널링의 억제에 의해 매개 될 수있다. 규제 완화 NFκB 경로는 치료 9-11로 종양 세포의 생존, 증식, 이동, 침윤, 혈관 신생, 및 저항을 촉진하기 때문에 중요하다. NFκB 경로의 활성화는 또한 장착 중요하다면역 반응. 따라서, 장기간 NFκB의 억제가 요구되는 항암 치료를 들어, 하나의 긴 지속 면역 억제와 관련된 해로운 부작용을 고려해야한다. 따라서, 치료는 ASA 최적화를위한 좋은 출발점이 될 수있다.
암 치료에 ASA 응용 프로그램에 대한 하나의 한계는 궤양과 위가 12, 13 출혈로 위장 독성과 관련된 사이클로 옥 시게나 제 ....
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프로토콜
아스피린 - 푸마 레이트 전구 약물 GTCpFE 1. 합성
- 메탄올 0.81 ㎖ (20 밀리몰)을 측정하고, 둥근 바닥 플라스크에서 10 ㎖의 물에 혼합 플라스틱 플런저 주사기를 사용. 빙수 욕에 플라스크를 놓고 0 ° C로 생성 된 혼합물을 냉각. 4- 히드 록시 벤질 알코올 (2.48 ㎎, 20 밀리몰)를 첨가하고, 용액이 깨끗해질 때까지 반응 혼합물을 교반 하였다.
- O의 -acetylsalicyloyl 클로라이드의 정량을 계량하고, 분리 플라스크 내의 용매에 용해시켜, 무수 톨루엔 (10 mL) 중의 O의 -acetylsalicyloyl 클로라이드의 용액 (3.77 ㎎, 19 밀리몰)을 준비한다. 플런저 플라스틱 주사기를 사용하여, 단계 1.1에서 제조 한 혼합물에이 용액을 첨가하고, 0 ℃에서 교반하여 반응을 떠난다.
- 박층 크로마토 그래피 (TLC)를 사용하여 반응을 모니터한다. TLC 판은 고정 위상 실리카가 있어야합니다.
- 20:80 에틸 아세테이트 (아세트산 에틸) / 헥산으로 이루어진 이동상을 준비한다. TLC 챔버 내의(또는 작은 용기)는 상기 챔버의 바닥을 덮 이동상 5 mL를 추가한다.
주 : 이동상의 양은 선택된 챔버에 의존한다. 항상 아래쪽을 덮도록 충분한....
- 20:80 에틸 아세테이트 (아세트산 에틸) / 헥산으로 이루어진 이동상을 준비한다. TLC 챔버 내의(또는 작은 용기)는 상기 챔버의 바닥을 덮 이동상 5 mL를 추가한다.
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결과
도 1에있어서, 사이토 카인에 대한 아스피린 푸마르산 전구 약물 GTCpFE, 그 저해 활성의 화학적 구조는 유방암 세포에서 NFĸB 경로를 유발하는 표시된다. GTCpFE는 세포 간 접착 분자 1 (ICAM1), 케모카인 CC 모티브 리간드 2 (CCL2), 및 종양 괴사 인자 (TNF) (그림으로 NFĸB 대상 유전자의 두 NFĸB 엔드 포인트, NFĸB-RE 루시 페라 제 활동 (그림 1B) 표현을 억제 MCF-7 유방암 세포에서 1C). 50 % 저해 농도를 계산 양쪽 엔드 포인트 (IC 50)의 값은 ~ 20 μM이다. IC 50 값은 그래프 소프트웨어를 사용하여 계산된다. 비교 ASA 자체도 200 μM (10 배 GTCpFE의 IC 50) 유방암 세포에는 저해 활성
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토론
이 프로토콜에서 우리는 유방암 세포에서 항-NFĸB 활성을 개선하기 위해 푸마르산염 약효단이 통합된 ASA 전구약물인 GTCpFE의 합성을 시연했습니다. GTCpFE는 효과적인 NFĸB 억제제인 반면, ASA 자체는 훨씬 더 높은 농도에서도 그렇지 않습니다. 푸마르산염 부분은 다양한 세포주 및 조직에서 NFĸB 신호 전달을 억제하는 능력으로 알 수 있듯이 항염증 특성을 가지고 있습니다14,25-29. 본원에 기술된 전구약물 전략은 여러 염증 경로가 활성화되고 병리에 기여하는 다른 악성 종양에 대해 수정될 수 있습니다. 따라서 GTCpFE는 새로운 푸마르산염 기반 항염증 및 항CSC 계열 약물 개발을 위한 원형이 될 수 있습니다. ASA 외에도 다른 비스테로이드성 항염증제도 사용할 수 있습니다. 이 경우 합성 경로도 다시 설계해야 합니다. 새로운 전구약물이 본원에 설명된 분석을 통해 항-NFĸB 및 항-시클로옥시게나제 활성을 유지하도록 하는 것이 중요합니다.
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립보건원(NIH)의 R01 CA200669과 GRJT의 R01 CA121107에서 제공한 보조금과 Susan G. Komen for the Cure to IK(PDF12229484)의 박사후 연구원 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
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| IMEM | Corning | 10-024-CV | 37까지 워밍업; C 사용 전 |
| DMEM / F12 중간 | ThermoFisher | 21041-025 | 37도까지 워밍업; C 사용 전 |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140 | |
| 페니실린 스트렙토마이신 | 생명 기술 | 15140-122 | |
| L-글루타민 100x | 라이프 테크놀로지스 | 25030-081 | |
| 인슐린 | 시그마-알드리치 | I-1882 | |
| 소 태아 혈청 | 애틀랜타 바이오로직스 | S11150 | |
| 트립신 2.5% 10x | 인비트로젠 | 15090046 | |
| 메틸 셀룰로오스 | 시그마 | M0262 | |
| B27 보충제 50x | Gibco | 17504-044 | |
| EGF | Gibco | PHG0311L | |
| NFκ B-RE 루시페라제 구성 | 클론텍 | pGL4.32 | |
| 레닐라 루시페라제 컨스트럭트 | Promega | pGL4.70 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668-019 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay | Promega | 120000032 | |
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| Eppendorf Mastercycler | Eppendorf | ||
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| QCapture 소프트웨어 | QImaging | ||
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| TRIzol | ThermoFisher | 15596-018 | |
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| 100 mM dNTP 세트 | Invitrogen | 10297-018 | |
| 랜덤 헥사머 | Invitrogen | 48190-011 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | 4385612 | |
| Costar 96W, 초저 부착물 | Corning | 3474 | |
| HBSS, 1x | ThermoFisher | 14025134 | |
| CD44-APC 접합 항체 | BD Pharmingen | 560990 | 4 °에 저장; C, 가벼운 |
| CD24-PE 항체 | BD Pharmingen 560991 | 4 °에서 저장; C, 빛 | |
| 재조합 인간 TNF 및 알파로부터 보호하십시오. | 피셔 | 210TA100 | |
| CCL2 프라이머 순방향 시퀀스 | AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC | ||
| CCL2 프라이머 역방향 시퀀스 | TCCTGAACCCACTTCTGCTTGG | ||
| ICAM1 프라이머 역방향 시퀀스 | TGACGAAGCCAGAGGTCTCAG | ||
| ICAM1 프라이머 순방향 시퀀스 | AGCGTCACCTTGGCTCTAGG | ||
| TNF 프라이머 순방향 시퀀스 | AAGGGTGACCGACTCAGCG | ||
| TNF 프라이머 역방향 시퀀스 | ATCCCAAAGTAGACCTGCCCA | ||
| 36B4 프라이머 순방향 시퀀스 | GTGTTCGACAATGGCAGCAT | ||
| 36B4 프라이머 역방향 시퀀스 | GACACCCTCCAGGAAGCGA | ||
| 수산화나트륨 | 시그마-알드리치 | S5881-500G | |
| 4-하이드록시벤질 알코올 | 시그마-알드리치 | 20806-10G | |
| O-아세틸살리실로일 클로라이드 | 시그마-알드리치 | 165190-5G | |
| 오산화인 | 시그마-알드리치 | 79610-100G | |
| 에틸 푸마로일 클로라이드 | 시그마-알드리치 | 669695-1G | |
| 황산나트륨 | 시그마-알드리치 | 246980-500G | |
| 4-디메틸아미노피리딘 | 시그마-알드리치 | 714844-100ML | 0.5 테트라하이드로푸란 |
| 트리에틸아민 | 시그마-알드리치 | T0886-100ML | |
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| 400 MHz FT NMR 분광계 | 브루커 참조' Avance 사용자' s 매뉴얼, 버전 000822 자세한 내용 |
참고문헌
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Cuzick, J., et al. Aspirin and non-steroidal anti-inflammatory drugs for cancer prevention: an international consensus statement. Lancet Oncol. ....
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