Interrenal steroidogenik Doku ve Zebra balığı Onun Vasküler Mikroçevre görselleştirme

Özet

Zebra balığı interrenal bezi memeli adrenal bezin teleostean karşılığıdır. Enzimatik aktivite deneyi, gelişmekte olan Zebra balığı farklılaşmış steroidogenik hücreleri tespit; Bu protokol 3-β hidroksisteroid dehidrojenaz (3β-Hsd Δ ^5-4 izomeraz) nasıl gerçekleştirileceği tanıtır.

Özet

Bu protokol, basit bir tam montajlı enzimatik aktivite testi yoluyla farklılaşmış interrenal steroidojenik hücrelerin nasıl tespit edileceğini tanıtır. 3-β-Hidroksisteroid dehidrojenaz / Δ^5-4 izomeraz (3β-Hsd) aktivite pozitif hücrelerin kromojenik histokimyasal boyanması yoluyla farklılaşmış steroidojenik dokuların tanımlanması, sırasıyla memelilerde ve teleostlarda adrenokortikal ve interrenal dokuların morfolojisini ve farklılaşmasını izlemek için kritik öneme sahiptir. Zebra balığı modelinde, gelişmekte olan embriyoların ve larvaların optik şeffaflığı ve doku geçirgenliği, 3β-Hsd aktivitesinin tam montajlı boyanmasına izin verir. Gelişmekte olan pronefrik ve endotel hücrelerini işaretleyen transgenik floresan raportör hatlarında gerçekleştirilen bu boyama protokolü, böbrek ve komşu damar sistemine ek olarak steroidojenik interrenal dokunun da saptanmasını sağlar. Vibratom kesiti, immünohistokimya ve konfokal mikroskopi ile birlikte, interrenal steroidojenik dokuların vasküler mikroçevresini görselleştirebilir ve test edebiliriz. 3β-Hsd aktivite testi, zebra balığı interrenal bezinin hücre biyolojisini incelemek için gereklidir, çünkü bugüne kadar zebra balığı steroidojenik hücrelerini etiketlemek için uygun bir antikor mevcut değildir. Ayrıca, bu test hızlı ve basittir, bu nedenle adrenal (interrenal) genetik bozuklukları hedefleyen mutant taramalar için ve ayrıca farmasötik veya toksikolojik çalışmalarda kimyasalların steroidogenez üzerindeki bozulma etkilerini belirlemek için güçlü bir araç sağlar.

Giriş

böbreküstü bezi, hipotalamus-hipofiz-adrenal ekseninin önemli bir bileşeni, steroid salgılar ve steroid homeostazı ve strese bedensel yanıtını koordine eder. böbrek üstü bezi katekolamin sentezleyen bir bölge-spesifik bir şekilde steroid salgılayan dış korteks ve iç medulla içerir. Teleostlarda interrenal bezi, memelilerde adrenal bez karşılığıdır ve adrenal korteks ve medullada sırasıyla ^1-3 fonksiyonel eşlenikleridir steroidojenik interrenal ve kromafin hücreleri, oluşmaktadır. Zebra balığı model kullanarak yapılan çalışmalar, hem steroidogenik ve kromaffin hücre soylar yüksek memelilerde ^1,2 benzeyen moleküler ve hücresel mekanizmaları tarafı....

Protokol

Etik Beyanı: zebrabalıkları tüm deneysel prosedürleri Tunghai Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi (KİK Onay NO 101-12.) Ve onaylı kurallarına uygun olarak gerçekleştirdi.

3β-Hsd enzimatik Aktivite Boyama için 1. Stok Çözümleri

1. trans-dehidroepiandrosteron [dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mg / ml] hazırlayın.
2. β-nikotinamid adenin dinükleotid hidrat (0.1 M fosfat tampon maddesi içinde 1.2 mg / ml, pH 7.2) hazırlayın.
3. Nikotinamid hazırlanması (B3 vitamini, 50 mg / ml _H2O).
4. 4-nitro mavi tetrazolyum (50 mg / ml% 70 dimetilformamid) hazırlayın.
....

Sonuçlar

Pronephric böbrek glomerül ve doğmakta olan damarsal ile steroidogenik interrenal doku codevelops, 3β-Hsd enzimatik aktivite deneyi çift transgenik Tg (wt1b: GFP) üzerinde gerçekleştirildi nasıl belirlemek için ^LI1; Tg (kdrl: mCherry) ^ci5 embriyo 34 hpf (Şekil 1). Bu aşamada, 3β-Hsd aktivitesi pozitif steroidogenik doku sağ orta hatta yer alan ve bazı steroidogenik hücreler orta hatta genelinde göç başlar ve dorsal görünümünden bir.......

Tartışma

3β-HSD aktivitesinin sinyal gücü reaksiyon boyunca arttı. 3β-HSD aktivitesinin net sinyaller itibaren 28 HPF gelen aşamaları için reaksiyon 4 saat sonra tespit edildi. Bununla birlikte, reaksiyon süresi deneyi amacına bağlı olarak, ampirik belirlenmesini gerektirir. boyama gece boyunca işlem gerektirir durumlarda, hafif mavimsi arka örneklerinin geliştirme eğilimindedir. Bu sorun, 3β-HSD 'aktivitesi boyama önce sabitleme süresi (örneğin, oda sıcaklığında 4% PFAT 4 saat) arttırarak aşılabilir. Bu, oda sıcakl.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Konfokal mikroskop	Carl Zeiss	LSM510 ve nbsp;
DMSO	Sigma	D8418
Gliserol	USB	US16374
Hyclone Fetal Baldır Serumu	GE Sağlık Yaşam Bilimleri	SH30073
Nikotinamid	Sigma	N0636
ve beta;-Nikotinamid adenin dinükleotid hidrat	Sigma	N1636
4-Nitro mavi tetrazolyum	Promega	S380C
Nusieve GTG	Lonza	50081
Paraformaldehit	Sigma	P6148
Feniltiüre	Sigma	P7629
Fosfat tamponlu tuzlu su	Sigma	P4417-100Tab
PYREX Spot Plaka	Corning	7220-85
Resif Tuzu	AZOO	AZ28001
trans-Dehidroandrosteron	Sigma	D4000
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vibratom	Leica	VT1000M