Высокая пропускная способность, в режиме реального времени, двойного считывания Тестирование внутриклеточного антимикробной активности и эукариотической клетки цитотоксичность

Summary

Был разработан высокопроизводительный анализ в реальном времени для одновременной идентификации (1) противомикробных препаратов, проникающих в эукариотические клетки, нацеленных на внутриклеточный бактериальный патоген, и (2) оценки цитотоксичности эукариотических клеток. Вариация той же технологии была впоследствии объединена с технологией цифрового дозирования, чтобы обеспечить проведение легких исследований с высоким разрешением, зависимости «доза-реакция», а также двух- и трехмерного синергетического эффекта.

Abstract

Традиционные меры внутриклеточного антимикробной активности и эукариотических клеток цитотоксичности полагаются на конечных анализов. Такие конечные точки анализы требуют несколько дополнительных экспериментальных шагов до начала считывания, такие как лизис клеток, определение элементарной колониеобразующих или добавления реагента. При выполнении тысячи анализов, например, во время высокопроизводительного скрининга, усилие вниз по течению, необходимое для этих типов анализов значительна. Поэтому, чтобы облегчить высокую пропускную способность противомикробное открытие, мы разработали анализ в режиме реального времени для одновременного идентификации ингибиторов внутриклеточного роста бактерий и оценки эукариотической клетки цитотоксичность. В частности, обнаружение внутриклеточный рост бактерий в режиме реального времени стало возможным благодаря маркировке бактериальных штаммов скрининга либо с бактериальным лк оперона (1 - ^е поколение) для анализа или флуоресцентный белок репортеров (2 - ^го поколения, ортогональным анализ). Нетоксичное, клеточная мембрана-impermeant, кислотно-связывающий краситель нуклеиновойТакже была добавлена ​​во время первичного инфицирования макрофагов. Эти красители исключаются из жизнеспособных клеток. Тем не менее, нежизнеспособные клетки-хозяева теряют целостность мембраны, разрешающий вход и флуоресцентного мечения ядерной ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Следует отметить, что связывание с ДНК связано с большим увеличением флуоресцентного квантовым выходом, который обеспечивает считывание решение на основе гибели клетки-хозяина. Мы использовали этот комбинированный анализ для выполнения экран высокой пропускной способностью в формате микропланшетов, а также для оценки внутриклеточного роста и цитотоксичности с помощью микроскопии. Следует отметить, что противомикробные может демонстрировать синергизм в которых комбинированное действие двух или более антимикробных при применении вместе больше, чем при применении по отдельности. Тестирование на синергии в пробирке против внутриклеточных патогенов , как правило, чудовищный задача , как должна быть оценена комбинаторные перестановками антибиотиков при различных концентрациях. Тем не менее, мы обнаружили, что наши в режиме реального времени анализа в сочетании с автоматизированной, цифровой технологии раздаточного рermitted легкое тестирование синергии. Используя эти подходы, мы были в состоянии систематически обследовать действие большого числа одних антимикробных и в сочетании с внутриклеточным патогеном, легионелл.

Introduction

Возбудители, которые растут или временно проживают в внутриклеточным трудно терапевтически искоренить. Облигатные или относительно облигатные внутриклеточные патогены , такие как легионелл, Coxiella burnetii, Brucella SPP. , Francisella tularensis и Mycobacterium SPP. часто требуют длительного курса антибактериальной терапии для лечения, которые могут варьироваться от нескольких месяцев до даже лет. Кроме того, внеклеточные патогены могут скоротечно занимают внутриклеточные ниши и таким образом избежать зазора обычными курсами антибактериальной терапии, а затем появляются, чтобы начать новые раунды вирулентных инф....

Protocol

1. в реальном масштабе времени внутриклеточный роста и эукариотической клетки цитотоксичности

1. Подготовка клетки-хозяева (J774A.1 клетки)
   1. Культура J774A.1 Mus Musculus макрофагами , как клетки в суспензии в среде RPMI 1640 с 9% железа с добавкой сыворотки теленка. Первоначально канал в культуре ткани колбы. После того, как клетки становятся конфлюэнтными в 75 см ² культуре ткани колбу в 15 мл среды, разделить их скребком и разбавлением до 65 мл с тем же типом среды, из которых 15 мл возвращают в колбу с тканевой культурой и 50 мл переносят в 250 мл бактериальной шейкер колбу.
   2. Для расширения масштабов, культуры в суспен....

Results

Микропланшетов внутриклеточный анализ роста

Рисунок 1 Схемы этапы анализа. Автоматизированные шаги, показанные могут быть выполнены вручную. Однако пропускная способность значительно облегчается с использованием жидких систем обработки.

На рисунке 2 показаны репрезентативные результаты из 384-луночный микропланшет, двойного считыван.......

Discussion

Мы описываем анализы в режиме реального времени для одновременного обнаружения внутриклеточного роста бактерий и клетки-хозяина цитотоксичности. Есть несколько важных шагов в протоколе. Во-первых, для надежного проведения анализа, должно быть достаточным, спектральное разделение между бактериальными и цитотоксичности считываний. Такое разделение свойственно для комбинаций люциферазы репортеров оперона и флуоресцентные ДНК-связывающих красителей. Однако, основываясь на нашем опыте (Таблица 1-3, Р.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
J774A.1 клетки	Американская коллекция типовых культур	TIB-67	Клетка-хозяин
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Для изготовления буферного древесного угля дрожжевого экстракта агара и буферной среды дрожжевого экстракта
Дрожжевой экстракт, ультрафильтрованный	Becton-Dickinson/Difco	210929	Для изготовления буферного древесного экстракта дрожжей агара и буферизованной среды для дрожжевого экстракта; более низкие сорта могут вызвать нарушение роста и/или изменить чувствительность легионеллы к ингибиторам роста
Альфа-кетоглутаровая кислота, соль монокалия	Sigma-Aldrich	K2000	Для изготовления буферного древесного угля дрожжевого экстракта агар и буферизованной среды дрожжевого экстракта
Пируват натрия	Sigma-Aldrich	P5280	Для изготовления буферного экстракта древесного угля дрожжей агар и буферной среды дрожжевого экстракта
Фосфат калия, двухосновной	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Для изготовления буферного древесного экстракта дрожжей агар и буферизованной среды дрожжевого экстракта
L-цистеин	Sigma-Aldrich	C-7755	Для приготовления буферного древесного экстракта дрожжей агара и буферной среды
дрожжевого экстрактаЦитрат аммонийного железа(III)	Sigma-Aldrich	F5879	Для изготовления буферного древесного угля экстракта дрожжей агар и буферизованной среды дрожжевого экстракта; вместо него можно использовать пирофосфат железа, но его сложнее точно взвесить
Раствор гидроксида калия, концентрированный	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Для приготовления буферного древесного угля дрожжевого экстракта агара и буферизованной дрожжевой экстрактной
среды Деонизированная вода	Н/Д	/Д	Для изготовления буферного древесного угля дрожжевого экстракта агара и буферной среды дрожжевого экстракта
Тимидин (тканевая культура)	Sigma-Aldrich	T1895	Для дополнения как RPMI 1640, так и буферного экстракта дрожжей агар/среда — тимидин более низкого качества может быть использован для последнего, но может вызвать нарушение роста клеток и/или гибель клеток в RPMI 1640
RPMI 1640, стандартная формула	Corning через Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Для выращивания клеток J774A.1 перед покрытием; включает 2 мМ L-глутамина.
RPMI 1640 не содержит фенола красного	Corning через Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Для гальванизации клеток J774A.1 в 384 луночных чашках (не подходит для роста до осаждения); также отсутствует L-глутамин — добавление до 2 мМ перед использованием
L-глютамина, 200 мМ в 0,85% NaCl (класс культуры ткани)	HyClone через Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Для дополнения RPMI 1640 без L-глютамина, до 2 мМ конечная концентрация
Сыворотка теленка с добавлением железа	Gemini Bioproducts	100-510	Для добавки RPMI 1640, до 9,1% конечной концентрации
Trypan Blue раствор	Sigma-Aldrich	T8154	Для окрашивания для определения гибели клеток J774A.1 при подсчете плотности клеток
SYTOX Green, 5 мМ раствор в DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Для окрашивания на J774A.1 для определения гибели клеток методом флуоресцентного чтения или эпифлуоресцентной микроскопии (в сочетании с оранжево-красными или дальними красными флуоресцентными бактериями). Использовать при конечной концентрации 125 нМ.
Инкубатор для клеточных культур	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Для инкубации клеток J774A.1 (как до, так и после заражения); также может использоваться для инкубации бактерий, либо вместо него может быть использован стандартный атмосферный инкубатор)
Орбитальный шейкер	BellCo Glass	7744-01010	Для встряхивания инкубации клеток J774A.1 перед инфекцией; помещается внутри инкубатора для клеточных культур; включает в себя основание шейкера 7744-01000 и лоток 7740-01010 (они также приобретаются отдельно)
Шейкер колбы (250 мл)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Для встряхивания инкубации клеток J774A.1 перед инфекцией
Шейкер зажимы для колб (250 мл)	BellCo Glass	7744-16250	Для встряхивания инкубации клеток J774A.1 перед инфекцией
Шейкеры колбы (1,000 мл)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Для встряхивания инкубации клеток J774A.1 перед инфекцией
Шейкеры для колб (1,000 мл)	BellCo Glass	7744-16100	Для встряхивания инкубации клеток J774A.1 перед инфекцией
Губчатые пенопластовые колпачки для колб (250 мл-1,000 мл)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	Для встряхивания инкубации клеток J774A.1 перед инфекцией; снижает риск загрязнения относительно стандартных металлических колпачков
Программируемый многоканальный перистальтический насос MultiDrop Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300	Для дозирования элементов J774A.1, среды и бактериальной суспензии, содержащих флуорофоры, в большое количество 384 луночных чашек
Комбинированный коллектор стандартного отверстия	Thermo Fisher Scientific	24072670	Стандартный объем предварительной выдачи 20 μ l недостаточно для компенсации усадки — увеличение до 80 μ l
Белые 384 луночные чашки, обработанные для культуры тканей	Corning	3570	Для чтения люминесценции и флуоресценции; По каталогу Greiner # 781080 также успешно протестирован
ДМСО (культура ткани, в герметичных ампулах)	Sigma-Aldrich	D2650	Для растворения положительных контрольных и тестовых соединений
Азитромицин	Sigma-Aldrich	PHR1088	Антибиотик положительного контроля
Сапонин (из коры Quillaja)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity положительный контроль
Многоканальный пипеттор	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	Для переноса фиксированных количеств положительных контрольных соединений; пипетка должна иметь цифровое дозирование с фиксаторами для обеспечения повторяющегося диспенсирования фиксированного объема
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Специальное оборудование)	Для переноса фиксированных количеств тестовых соединений из библиотечных массивов
D300 цифровой системы дозирования	Hewlett-Packard через Tecan	D300	Для переноса различных количеств исследуемых соединений в диапазоне от 11 пиколитров до 10&мкм; l
Картриджи T8+ для цифровой системы дозирования D300	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	Для дозирования тестовых соединений
Эпифлуоресцентный микроскоп с подключенной к компьютеру цифровой камерой	Nikon	Ti	Для визуализации живых клеток; любой стандартный флуоресцентный микроскоп может заменить его, с помощью фазового контраста или оптики DIC, способного отображать зеленую (флуоресцеин), оранжево-красную до красной (Texas Red) и дальнюю красную (Cy5) флуоресценцию, с 100-кратным маслом объектив для высочайшего разрешения
Чашки для культуры тканей со стеклянным дном	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Для визуализации живых клеток. Такие приборы, как MatTek, позволяют визуализировать микроскопы с увеличением 600X или 1000X с помощью инвертированного эпифлуоресцентного или конфокального микроскопа. Эти специфические посуды имеют номинальный диаметр 3,5 см, внутренний диаметр 3,3 см, в дно вставлены покровные стекла диаметром 20 мм #1,5
Photoshop, CS6	Adobe		, Photoshop или аналогичные программы можно использовать для псевдораскрашивания и объединения световых, микроскопических и флуоресцентных изображений.
Mathematica 10	Wolfam		Для генерации двухмерных изоконтурных изоболограмм и трехмерных поверхностных изоболограмм.