Abstract
관찰과 소나무 선충, Bursaphelenchus의 xylophilus의 짝짓기 행동을 정량화하기위한 방법은, 실체 현미경 아래 설립되었다. B. Xylophilus의 결합 효율을 향상시키고 상대 관찰 가능성을 증가시키는, 버진 성인 배양하고, 조사에 사용. 계란은 물에 선충을 유지하고, 여성은 10 분 동안 알을 낳기 수 있도록함으로써 얻을 수 있었다. 2 단째 유생 (J2)는 어둠에서 25 ° C에서 24 시간 동안 난자를 배양하여 동기화하고, 초기 J4 또 다른 52 시간 동안, 잿빛 곰팡이, 보 트리 티스 시네 레아와 J2를 배양함으로써 얻어졌다. 이 시점에서, 가장 J4 선충은 생식기 형태를 사용하여 남성 또는 여성 인 것으로 명확히 구별 될 수있다. 남성과 여성의 J4 수집하고 처녀 성인 선충을받을 24 시간 동안 두 개의 서로 다른 배양 접시에서 분리 배양 하였다. 처녀 남성과 처녀 여성은 와트의 드롭 쌍 하였다오목 슬라이드의 잘 어. 정합 동작은 실체 현미경 비디오 레코더로 촬영했다. 결합 프로세스의 전체 시간은 82.8 ± 3.91 분 (± SE 평균)이고 4 개의 단계로 나눌 수있다 : 검색, 접촉 교미 및 느린. 구간의 평균 분은 각각 21.8 ± 2.0, 28.0 ± 1.9, 25.8 ± 0.7 및 7.2 ± 0.5이었다. 일레븐 서브 행동을 설명했다 :, 순항 접근, 발생, 반원형 누수 방지 공법, 터치, 위치, 부착, 사정을, 정지를 분리하고, 로밍. 한 여성이 3 명의 남성 3 명의 여성과 한 남성과 함께 그룹화 할 때 흥미롭게도, 분명 내 성적 경쟁이 관찰되었다. 이 프로토콜의 B. xylophilus의 결합 거동을 조사에서뿐만 아니라 다른 선충 ethological 연구를위한 기준으로서 작용에서뿐만 아니라, 유용하고 귀중하다.
Protocol
버진 성인 선충 1. 취득
- 파인 우드 선충의 분리 및 배양 조건
B를 xylophilus Nxy61 원래 중국 절강 성 닝보 지역에서 병에 걸린 Pinus의 massoniana에서 추출 분리 : 주.- (PDA 재료의 표 참조) 감자 포도당 한천을 준비 보 트리 티스 시네 레아를 성장 판.
- 접종 들어 B. 시네 메트에서 10mm의 직경을 갖는 매트 진균의 조각을 펀칭하고 새로운 PDA 플레이트의 중간에 넣어. 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 5 D에 대한 B. 시네.
- 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 B. 시네을 포함하는 준비된 배양 접시에있는 파인 우드 선충.
- B. xylophilus 계란의 취득
- 깔때기 아래에 고정 고무 튜브를 놓고 조립하는 랙에 제조 된 깔때기를 개최Baermann 깔때기 장치. 깔때기의 입에 종이 필터 대신 거즈 두 레이어를 놓습니다.
- 유입 경로 설정에 곰팡이 문화를 전송하고 곰팡이 매트가 침지 될 때까지 물을 추가합니다. 2 시간을 기다린 선충은 곰팡이 문화에서 나올 여과지를 통과하고 Baermann 깔때기의 가장 낮은 부분에 정착 것입니다.
- 15 ML의 튜브에 튜브의 바닥에서 물 방울의 첫 번째 부부를 수집하고 천천히 튜브 클램프를 풀어 선충를 수집합니다.
- 실온에서 2 분 동안 3,000 XG에서 위의 컬렉션을 원심 분리기.
- 피펫 물의 상층을 제거하고 멸균 이중 증류 (DD)의 1 mL의 H 2 O와 함께 재현 탁
- 피펫으로, 새로운 유리 페트리 접시 (6cm 직경)에 위의 부유를 전송합니다. 선충 자유롭게 수영을 할 수 있는지 확인하기 위해 페트리 접시에 무균 DD의 H 2 O 3 ML을 추가합니다.
- 한 유리의 선충을 유지어둠 속에서 25 ° C에서 10 분 동안 배양 접시에요. 계란은 임신 한 여성에 의해 배치됩니다. 때문에 당 단백질 표면의, 계란 유리 페트리 접시의 바닥에 충실 할 것이다.
- 계란을 방해하지 않고, 조심스럽게 물과 벌레를 제거합니다. 건조에서 계란을 방지하기 위해 즉시 유리 페트리 접시에 무균 DD의 H 2 O 3 ML을 추가합니다.
- 단계를 반복 1.2.8 배는 모든 애벌레와 어른을 제거하고 순수한 계란을 얻었다. 페트리 접시에 무균 DD의 H 2 O의 추가 2 ㎖ (총 5 ㎖)를 추가합니다.
- 네 번째 단계 청소년의 취득 (J4 유충)
- 해치 25 ℃에서 어둠 속에서 24 시간 동안 수집 된 계란 J2 유충을 얻었다.
- 2 분 동안 3,000 XG에 15 ML의 튜브, 원심 분리기에 피펫으로 J2 유충을 전송, 물 상층을 제거합니다.
- 멸균 DD의 H 2 O의 200 μL와 J2 유충을 재현 탁하고로 전송B. 시네을 포함하는 PDA 판.
- 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 52 시간의 J2 애벌레. 이 시점에서, 대부분의 유충 J2 J4 유충의 초기에 개발 된 것이다.
- 처녀 성인 선충의 취득
- 알코올 버너 동안 가열 한 후 유리 모세관을 그려 선충을 따기위한 바늘을 준비합니다.
주 :이 모세관 바늘의 팁은 일반적으로는 단일 선충류를 픽업하기위한 도구로서 이용 될 수 있도록, 직경 50㎛의 성인 선충 대략 차체 폭 할 필요가있다. - Baermann 깔때기를 조립하고 단계 1.2.1에 기술 된 바와 같이, 2 시간 동안 곰팡이 문화 선충을 추출 - 1.2.3.
- 깨끗한 페트리 접시에 물을 J4을 전송합니다.
- 실체 현미경 하에서 선충을 관찰하고 마미야와 기요하라 (8) (그림 1에서 설명 된 바와 같이, 성기 형태로 남성과 여성을 구분 주 : 남성보다 여성이 60에서 여성의 비율에있다 - 70 %. 여성 외음부는 남성 spicule에서 분명히 다르다. 성인에 비해 초기 단계 J4에서 spicule 또는 외음부는 작지만 여전히 쉽게 볼과 구별 될 수있다. 선충은 항상 때로는 남성과 여성을 구별에 어려움을 증가 물에서 움직이고있다.
- 문화 어둠 속에서 25 ° C에서 또 다른 24 시간의 J4 애벌레.
참고 : 모든 선충은 성인으로 발전해야하지만, 그들이 결합 해제하기 때문에, 그들은 처녀 성인으로 간주됩니다. - Baermann 유입 경로 둘을 조립하고 단계 1.2.1에 기술 된 바와 같이, 2 시간 동안 곰팡이 문화 처녀 성인을 추출 - 1.2.3, 그리고 두 개의 분리 된 깨끗한 페트리 접시에 처녀 성인 남성과 여성을 전송합니다.
2. 관측 및 짝짓기 행동의 비디오 녹화
- 여러 오목 슬라이드를 준비하고 자신의 우물 각 멸균 DD의 H 2 O의 200 μL를 추가합니다.
- 모세관 바늘로 준비된 처녀 성인 남성 또는과 여성을 선택하고 각 오목 슬라이드의 물에 하나의 선충을 넣어.
- 그들이 새로운 수성 환경에 적응할 수 있도록 1 시간 동안 잘 내부의 처녀 성인을 유지합니다.
- 피펫을 사용하여 다른 잘 하나에서 둘 중 하나를 전송하여 처녀 남성과 여성의 쌍.
- 실체 현미경 아래 오목 슬라이드에 1♀ + 1♂ 조합의 짝짓기 행동을 관찰한다.
- 버진 성인의 결합 효율을 분석하기 위해, 그 결합 성공률 (R)을 계산하고, 무작위로 선택된 성인 쌍의 것과 비교한다. 교미가 공부 복제의 총 개수에 비해 관찰 된 복제의 백분율 R을 계산한다.
- 정량적 분석을위한 데이터를 수집하기 위해, 비디오 현미경을 사용하여 결합 동작을 촬영. 일반적으로, 그들이 교미 후 멀리 이동할 때 선충이 모멘트에 오목 슬라이드의 웰에 배치 된 시점으로부터 전체 정합 프로세스는 2 시간 이내에 완료된다. 따라서 하나의 복제에 적어도 2 시간 동안 연속하여 정합 처리를 기록한다. 최소 30 전체는 각 조합의 총에 복제합니다.
주 : 기록 과정에서 증발을 보상 할뿐만 더 무균 DD의 H마다 0.5 H 2 O (통상 50 μL)을 추가한다.
3. 데이터 수집
- 컴퓨터 화면에 신중하게 모든 동영상을보고 성적 하위 행동 특성.
- 결합하여 일의 기간을 측정비디오 레코더의 전자 프레임 별 기능. 수동 종단점으로부터 시작 시간을 뺀다.
- 1♀ + 1♂ 조합은 각 녹화를 분석하여 다음과 같은 이벤트의 지속 시간을 측정한다 :
- 검색하는 시간을 측정 (즉, 암수가 그들이 발생하는 모멘트에 오목 슬라이드의 웰에 넣고 서로 접촉 할 때까지의 시간).
- 접촉의 지속 시간을 측정한다 (즉, 수형 정확하게 제 교미 위해 여성의 외음부에 위치하는 순간에 제 접촉까지의 시간).
- 교미의 지속 시간을 측정 (즉, 자신이 사정 한 후 아래로 여성의 몸에서 슬라이드까지 남성이 정확하게 여성의 외음부에 위치 할 때까지의 시간). 참고 : 일부 선충은 2 시간에 여러 번 교접 할 수 있습니다. 이러한 경우, 라스의 끝에서 제 교미 교미 기간을 측정사이의 시간을 포함하여 t 하나.
- 여운의 지속 시간을 측정한다 (즉, 교미 후 기간 암수 수영 서로 떨어져 그리고 더 선충의 몸 길이 이하의 간격으로 분리 될 때까지 (통상 1 ㎜)).
- 교미 주파수와 모든 교미 기간과 다른 조합의 각각에 대해 2 시간에있는 모든 교미의 평균 시간을 계산합니다 (즉, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ 및 1♀ + 3♂).
- 즉시 끊김없이 수행되는 첫 접촉 후 짝짓기 성공률로 상이한 조합에 대해 먼저 접촉 (P)에 대한 상대 성공율을 계산한다. 접촉 단계에서는 여러 연락처는 실제 교미하기 전에 관찰 될 수 있습니다.
- 두 개인 사이의 거리는 상기 본체의 길이 이상이면 이상으로 하나의 접촉을 고려한다. 하나의 복제, 기록 P 100 %의 교미의 난에 대한의는 휴식없이 첫 접촉 후 즉시 관찰, 또는 0.00 % 더 교미가 관찰되지 않은 경우 또는 교미하지만 두 개 이상의 접점 후이 있다면.
참고 : 여기에 설명 된 각 조합에 대한 30 복제가 있었다.
- 두 개인 사이의 거리는 상기 본체의 길이 이상이면 이상으로 하나의 접촉을 고려한다. 하나의 복제, 기록 P 100 %의 교미의 난에 대한의는 휴식없이 첫 접촉 후 즉시 관찰, 또는 0.00 % 더 교미가 관찰되지 않은 경우 또는 교미하지만 두 개 이상의 접점 후이 있다면.
- 알코올 버너 동안 가열 한 후 유리 모세관을 그려 선충을 따기위한 바늘을 준비합니다.
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Representative Results
처녀 성인의 짝짓기 성공률 (R)가 무작위로 선택된 성인에 비해 유의하게 높았다하는 평균 86.67 %이었다 : 13.33 ± 4.65 % (F = 1301.71, DF = 1, P = 0.0001) (그림 2). 이 발견은 B의 xylophilus 무작위로 선택된 성인보다 처녀 성인 짝짓기 행동을 관찰하기 쉽다는 것을 의미한다.
한 남성이 여성 하나와 결합되었을 때 전체 정합 프로세스는 평균 82.8 분 동안 지속되었다. 전체 프로세스는 네 가지 단계로 설명 될 수있다 : 검색 접촉 교미 및 느린. 이 네 단계의 기간은 21.8 ± 2.0 분, 28.0 ± 1.9 분, 25.8 ± 0.7 분, 7.2 ± 0.5 분, 각각 (그림 3)이었다. 최근 게시, 우리는 encounteri, 순항 접근로 (11)의 서브 동작을 설명NG, 감동은 반원형 누수 방지 공법, 부착 사정을, 분리, 정지를, 9 로밍, 위치.
한 남자가 동시에 두 개 이상의 여성을 만났을 때, 남성은 선택하지 않고, 그들 중 하나를 무작위로 짝짓기를 보였다. 그러나, 확실한 결합 선택은 여성의 B. xylophilus 관찰되었다. 여성이 남성과 접촉 할 때, 여성은 그녀의 머리를 부드럽게 남성의 머리, 몸, 꼬리와 생식기 영역을 터치하는 경향이 그녀의 잠재적 인 파트너를 평가하는 것으로 보였다. 여성은 남성에 동의하지 않은 경우, 여성은 빨리 그를 떠나 다음 평가를위한 또 다른 남성에 수영. 남성 중 하나는 다음 상대의 여성으로 선정되었다. 의 첫 번째 접촉 (P) 후 성공률 짝짓기 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ 및 1♀ + 3♂ 조합은 각각 46.7 ± 9.3 %, 80.0 ± 7.4 %, 23.4 ± 7.4 %였다, 그들 사이의 차이 WER전자 유의 한 (F = 8.21, DF = 2, P = 0.0124) (그림 4).
Intrasexual 경쟁은 남성과 여성 모두에서 관찰되었다. 한 처녀 여성이 세 처녀 남성과 혼합되었을 때, 남성이 접근하고 그녀와 짝짓기의 기회를 얻기 위해 가능한 한 많은 여성의 연락을 시도했다. 외음부가 한 남성에 의해 점령되었을 때, 다른 남성은 폭력적인 몸의 스윙을 사용하거나 분리하는 드래그하여 상대 남성을 방해하려고 노력했다. 여성 intrasexual 경쟁은 남성 intrasexual 경쟁에 다소 유사한 것으로 나타났다.
짝짓기 성공은 주로 여성에 의존. 여성이 남성을 수락 할 때, 남성은 더 느리게 이동 말리거나 심지어 후프를 형성하고, 여성은 쉽게 남성이 그녀의 외음부를 찾는 다른 남성의 간섭을 방지 할 수 있도록 적극적으로 전진. 여성은 남성에 동의하지 않은 경우,여성은 남성에 장착 한 경우에도, 그를 떨쳐 버려야 노력하고 그녀의 외음부에 의해 자신을 위치. 때문에 intrasexual 경쟁, 교미 상기 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂의 주파수 및 1♀ + 3♂ 조합은 각각 1.43 ± 0.091, 1.17 ± 0.074 및 1.83 ± 0.074이었다, 그리고 그들 사이의 차이가 있었다 유의 한 (F = 14.50, DF = 2, P = 0.0001) (그림 5).
조사에서, 교미 기간은 20의 최소 42 분에서 최대로 크게 변화. 10 분보다 길게 지속 미만 5 분간 지속 단기 교미, 장기 교미 : 우리의 데이타에 의하면, 교미 기간 분명히 두 그룹으로 구분 될 수있다. 명백한 차이는 단기 교미 (F = 3.81의 평균 기간 동안 다른 그룹 사이 DF = 2, P를 관찰 (F = 179.52, DF = 2, P = 0.0001) 및 모든 교미 (F = 2.93, DF = 2, P = 0.0367) (도 6).
그림 1 : 남성과 여성 B. Xylophilus의 생식기. (가) 남성 (파란색 화살표)의 spicule. (나) 여성 (빨간색 화살표)의 외음부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 버진 성인 커플의 짝짓기 성공률와 B의 xylophilus의 무작위로 선택된 성인 커플. 계산 된 평균 값은 30 복제에서 있습니다. 수직 막대 쇼표준 오류에요. Tukey에의 시험으로 비교했을 때 서로 다른 소문자는 P <0.05에서 유의 한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 : B.의 xylophilus의 결합 과정에서 4 페이즈 기간. 계산 된 평균 값은 30 복제에서 있습니다. 수직 막대는 표준 오류를 보여줍니다. Tukey에의 시험으로 비교했을 때 서로 다른 소문자는 P <0.05에서 유의 한 차이를 나타냅니다. 교미 단계의 평균 지속 기간은 전체 정합 프로세스의 31.17 %로 25.80 ± 0.71 분이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오URE.
그림 4 : B.의 xylophilus의 첫 번째 기업에게 짝짓기 성공. 계산 된 평균 값은 SE ± 30 복제에서 있습니다. Tukey에의 정직 유의 한 차이 시험으로 비교했을 때 각 열 내에서 동일한 소문자로 의미는 P <0.05에서 유의 한 차이가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : B의 xylophilus 다른 그룹에서 교미 주파수. 계산 된 평균 값은 SE ± 30 복제에서 있습니다. P <0.05 완에 있지 크게 다르다 같은 소문자로 의미Tukey에의 정직 유의 한 차이 시험에 의해 ared. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : B.의 xylophilus의 교미 시간. Tukey에의 정직 유의 한 차이 시험으로 비교했을 때 컬럼의 각 세트 내에서 동일한 소문자로 의미는 P <0.05에서 유의 한 차이가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
행동 테스트는 화학 생태학, 신경 생물학, 분자 생물학, 유전학의 기본적인 부분입니다. 선충, 특히 C. 엘레은 광범위하게이 분야에서 연구에 사용됩니다. 선충의 짝짓기 행동은 이전에 10-11을 조사하고있다. 그러나, B.의 xylophilus는 자웅 이체와 자웅 동체 C. elegans의 다른이며, 그 결합 과정은 다른 행동 기능 9있다. 최근 Bursaphelenchus의 okinawaensis, B.의 xylophilus의 자웅 동체 자매 종의 짝짓기 행동은 12을보고되었다. 다른 실험 방법을 사용하고 있지만,이 자웅 동체 종, B.의 xylophilus 유사한 섹스 매력을 보여 주었다 그들 사이의 상호 종 매력이 관찰되었다. 이 자웅 동체 자매 종의 Bursaphelenchus의 생물학에 대한 추가 조사를 실시하는 모델로 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 준수와 B의 xylophilus 결합시 행동 특성을 조사하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 우리의 결과는 처녀 성인 선충을 사용하여 성공적으로 결합 프로세스 (도 1)를 관찰 할 가능성을 증가시키기위한 중요한 것으로 나타났다. J4 유충을 확보하고 정확하게 자신의 성별을 구별하는 것은 처녀 성인의 인수에 대한 두 가지 중요한 기본 단계입니다. 우리의 실험 조건 (즉, 어두운 곳에서 25 ℃), 52 시간의 기간 J2 유충으로부터 J4를 얻기 위해 적당한 시간 미만. 그러나, 초기 J4 단계에서 섹스를 구별하는 것은 주로 개인적인 경험에 따라 달라집니다. 다른 사람들이 섹스 할당을 한 번 확인하는 정확성을 보장하기 위해서는 필요하다.
결합 공정의 B. xylophilus 동안 행동 특징 네의 지속 기간과 다를를 기록함으로써 정 성적으로 설명하고 정량 할 수있다엔트 단계, 첫 접촉의 교미 주파수 및 다른 조합의 교미 기간 후 짝짓기 성공의 비율입니다. 흥미롭게도, 처음으로, 우리는 여성 및 남성과 여성 모두에서 강한 인트라 성적 경쟁 상대의 선택을 관찰 하였다. 어떤 성행위가 관찰되지 않았다; 그러나,이 조사에 사용 된 선충의 수가 제한으로 인해 수 있습니다. 이 프로토콜은 B.의 xylophilus의 결합 거동을 연구에 사용될 수 있지만, 다른 선충에 대한 기준으로서 유용하고 가치가있을 수있다.
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Acknowledgments
Najie 주홍 및 Liqun 바이는이 작품에 동일하게 기여했다. 이 작품은 재정적으로 공공 복지에서 임업 과학 연구를위한 특별 기금 (201,204,501)와 중국 국가 자연 과학 재단 (31170604, 31270688 및 31570638)에 의해 지원되었다. 우리는 영어 쓰기에 자신의 도움이 제안 박사 Holighaus 리트 박사 다니엘 Hickford 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B. xylophilus isolate Nxy61 | Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China | ||
| Grey mold strain | Obtained from Forestry Academy of China | ||
| Baermann funnels | Sengong | ||
| falcon tubes | Sengong | ||
| centrifuge | Sengong | ||
| pipette | Sengong | ||
| sterile dd H2O | Sterilized by high pressure of steam at 121 °C for 30 min. | ||
| Petri dishes | Sengong | ||
| PDA medium | Huankai Bio. | 021050 | |
| incubator | Sengong | ||
| Laminar flow | Sengong | ||
| glass capillary | Sengong | ||
| Stereoscope | Leica | LED5000 RL | |
| inverted stereo microscope | Zeiss | A1 | |
| concave slides | Sengong |
References
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