Оптимизированный протокол для электрофоретической подвижности Сдвиг Пробирной с помощью ИК-флуоресцентным красителем-меченных

Summary

Здесь мы опишем оптимизированный протокол флуоресцентных электрофоретической подвижности (анализах сдвига FEMSA) с использованием очищенного SOX-2 белки вместе с инфракрасным флуоресцентным красителем-меченых зондов ДНК в качестве примера для решения важный биологический вопрос.

Abstract

Электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) являются инструментальным средством для характеристики взаимодействия белков и их последовательностей ДНК-мишени. Радиоактивность была преобладающим методом мечения ДНК в EMSAs. Тем не менее, последние достижения в области флуоресцентных красителей и методы сканирования побудили применение флуоресцентного мечения ДНК в качестве альтернативы радиоактивности за преимущества простоты управления, экономии времени, снижения затрат и повышению безопасности. Недавно мы использовали флуоресцентный EMSA (FEMSA) успешно решать важный биологический вопрос. Наш анализ FEMSA обеспечивает механистического представление о влиянии миссенс-мутации, G73E, в высококонсервативной ГМГ фактора транскрипции SOX-2 по типу нейрон диверсификации обонятельной. Мы обнаружили , что мутантные SOX-2 ^G73E белок изменяет специфической ДНК связывающей активностью, вызывая тем самым обонятельный нейрон тождественное преобразование. Здесь мы представляем оптимизированные и экономически эффективный шаг за шагом протоколадля FEMSA с помощью инфракрасного флуоресцентного красителя-меченых олигонуклеотидов , содержащих LIM-4 / SOX-2 смежных целевых сайтов и очищенные SOX-2 белки (WT и мутантных SOX-2 ^G73E белки) в качестве биологического примера.

Introduction

EMSAs используются для анализа взаимодействия между ДНК и белками, используя нативный электрофорезом на геле полиакриламида (СТР) , чтобы разрешить смесь интересующего белка и меченой ДНК зонда , содержащего потенциальные целевые участки белка ^1. ДНК-зонд связан с белком будет мигрировать медленнее по сравнению со свободным ДНК-зондом, и, следовательно, задерживается в его миграции через матрицу полиакриламида. Радиоактивной ДНК ³² Р является основным методом для обнаружения в EMSAs. Хотя применение радиомечения в биохимических исследованиях было выгодным, методы альтернативной маркировки ДНК с сопоставимой чувствительностью в настоящее время ис....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: EMSAs с использованием флуоресцентно меченых зондов ДНК или другие формы меченой ДНК разделяют одни и те же протоколы для белка или препарата клеточного экстракта, белок-ДНК реакции связывания и подготовки PAGE гель и работает (рис 1А). Основные отличия процедуры ДНК маркировки, этапы обработки геля после бежать, и методы обнаружения.

1. Гель Приготовление

1. Готовят 5% геля, содержащего нативный полиакриламидный 0.5x TBE (45 мМ Трис-борат, 1 мМ ЭДТА) и 2,5% глицерина, с использованием мини-гель системы белка (8,3 см ширина х 7,3 см толщина длина х 0,75 мм).
   1. Для приготовления 30 мл раствора геля для 4 гелей, смеша....

Results

Оранжевый G красителем (6х: 0,12 г Оранжевый G в 100 мл 30% глицерина) может быть добавлен к реакции связывания перед загрузкой визуализировать ход электрофореза. Другие красители , включая погрузочные бромфенолового синего будут обнаружены во время сканирования и , следовательно , мешают анализу изображений (рис 1B).

В некоторых случаях EMSAs, особенно если препарат ядерный экстракт используется, поли deoxyin.......

Discussion

fEMSAs являются эффективным инструментом для изучения взаимодействия белок-ДНК, и являются альтернативой радиоактивное мечение ДНК. Флуоресцентные красители, такие как инфракрасные красители являются коммерчески доступными, а также обеспечить более безопасный и более экологически чистый метод по сравнению с радиоактивное мечение ДНК. EMSAs с использованием инфракрасного флуоресцентного красителя-меченных не требуют postrun стадий обработки гель, и, следовательно, сэкономить время и затраты по сравнению с другими методам.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% раствор акриламида/бис, 37,5:1	Bio-Rad	1610158	акриламид вреден и токсичен.
6x-HIS антитело к эпитопной метке (HIS. H8)	Антитела ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Бычий сывороточный альбумин (BSA) молекулярно-биологический класс	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-меченая ДНК Олигос	интегрированные технологии ДНК	Пользовательские олиго ДНК	В рукописи они упоминаются как «5'Меченные красителем или инфракрасные флуоресцентные меченные красителем олигопласты ДНК» в рукописи. Компания будет синтезировать 5'-меченые IRDye ДНК-олигонуклеотиды. Требуется минимум 100  μ Синтез в масштабе М и очистка ВЭЖХ.
Фрагмент Кленоу (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN  Вертикальная ячейка для электрофореза	Био-Рад	1658000FC	В рукописи это называется «мини-белковой гелевой системой». Можно использовать любые электрофоретические системы, если они представляют собой пластины из прозрачного стекла размером менее 25 см х 25 см.
Система инфракрасной визуализации Odyssey CLx	LI-COR Биотехнология	Система Odyssey CLx Infrared Imagng В	рукописи она упоминается как «усовершенствованная система инфракрасной визуализации».
Система визуализации Odyssey Fc	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	В рукописи она упоминается как «система флуоресцентной визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне, предназначенная в первую очередь для западных блоттингов».
Программное обеспечение Image Studio (версия 4.0)Программное обеспечение	LI-COR Biotechnology	Image Studio	В рукописи это называется «особым программным обеспечением для обработки изображений».
Оранжевый G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Оранжевый нагрузочный краситель			0,25% Orange G; 30% Глицерин
0,5x TBE			45 мМ Трис-борат; 1 мМ ЭДТА
1x TE			10 мМ Трис-HCl, pH 8,0; 1 мМ EDTA
1x STE			100 мМ NaCl; 10 мМ Tris-HCl, pH 8,0; 1 мМ EDTA
5x Связывающий буфер			50 мМ Tris-HCl, pH 7,5; 50 мМ NaCl; 200 мМ KCl; 5 мМ MgCl<суб>2; 5 мМ ЭДТА, pH 8,0; 5 мМ DTT; 250 μ г/мл BSA