Method Article

Количественный 3D В Silico Моделирование (q3DISM) церебрального бета-амилоида Фагоцитоз в моделях грызунов болезни Альцгеймера

DOI:

10.3791/54868

⸱

December 26th, 2016

 ,  , 
1Zilkha Neurogenetic Institute, University of Southern California (USC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали методику количественного 3D в силикомарганца моделирования (q3DISM) церебрального амилоида-бета (Ар) фагоцитоза мононуклеарных фагоцитов в грызунах моделях болезни Альцгеймера. Этот метод может быть обобщен для количественному практически любого фагоцитарной события в естественных условиях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейровоспаления в настоящее время признается в качестве основного этиологического фактора в развитии нейродегенеративных заболеваний. Мононуклеарных фагоцитов врожденные иммунные клетки, ответственные за фагоцитоза и обезвреживания мусора и наносов. Эти клетки включают CNS-резидентов макрофаги, известные как микроглии и мононуклеарных фагоцитов Проникнув с периферии. Световая микроскопия чаще всего используется для визуализации фагоцитоз в грызуна или образцов мозга человека. Тем не менее, качественные методы не предоставили окончательные доказательства фагоцитоза в естественных условиях. Здесь мы опишем количественный 3D моделирования в силикомарганца (q3DISM), надежный метод , позволяющий для истинного 3D количественному амилоида-бета (Ар) фагоцитоза мононуклеарных фагоцитов в моделях на грызунах Болезнь Альцгеймера (AD). Способ включает флуоресцентно визуализируя A & beta; инкапсулируются в фаголизосомах в разделах мозга грызуна. Большие Z-мерное конфокальной наборов данных затем 3D реконструированы для количественного A &# 946; пространственно локализуется в пределах фаголизосомы. Мы демонстрируют успешное применение q3DISM к мыши и крысы мозга, но эта методика может быть расширена до практически любого события в фагоцитарной любой ткани.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Болезнь Альцгеймера (AD), самый распространенный возраст слабоумие 1, характеризуется церебрального амилоида-β (Ар) накопления как "старческие" бета-амилоидных бляшек, хронический нейровоспаления низкого уровня, таупатия, гибель нейронов, а также когнитивные нарушения 2 , В AD мозге пациентов, нейровоспаления предназначается под воздействием реактивной астроциты и мононуклеарных фагоцитов (называемый микроглии, хотя их центральных против периферического происхождения , остается неясным) , окружающих A & beta ; 3 -х месторождений. Как врожденной иммунной часовыми ЦНС, микроглии централизованно расположены, чтобы очистить мозг A & beta.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Постановка исследовательской этики: Все эксперименты с участием животных , подробно описанные здесь , были одобрены Университета Южной Калифорнии Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) и осуществляется в строгом соответствии с национальными институтами руководящих принципов охраны здоровья и рекомендации от ассоциации по оценке и аккредитации лаборатории Animal Care International.

1. Грызун Изоляция мозга и подготовка к иммунным окрашиванием

1 ДЕНЬ:

  1. Поместите крыс в возрасте TgF344-AD (14-месячного) или APP / PS1 мышей (12-месячного) при непрерывной глубокой изофлурановым анестезии (4%). Оценка гл....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя методику многостадийного для q3DISM подробно описано выше, мы можем количественно оценить поглощение Ар в моноцитов фаголизосомах в мозге APP / PS1 мышей (рисунок 1) и крыс TgF344-AD (рисунок 2). Таким образом, методология q3DISM позволило анализ мононуклеарных фагоцитов в мышей и крыс моделей AD. Интересно отметить , что объем , занимаемый CD68 + фаголизосомах значительно увеличивается в Iba1 + мононуклеарных фагоцитов , .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол , который мы описываем в настоящем докладе , для истинного 3D количественного фагоцитоза Ар в естественных условиях с помощью мононуклеарных фагоцитов зависит от конкретной маркировки клеточных и субклеточных отсеков, а также A & beta ; месторождений. В частности, мы используем Iba1 (ионизированного кальция Связывание адаптера молекулы 1), белок , который участвует в мембранной рассердило и фагоцитоза при активации клеток 18, 19, окрасить мозговые мононуклеарных фаг.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M-V. Г-С. поддерживается премией BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) и премией Ассоциации Альцгеймера, Калифорнийским отделением Саутленда для молодых исследователей. T.M.W. поддерживается Фондом ARCS и Фондом Джона Дугласа Френч Альцгеймер Мэгги Макнайт Рассел-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. Эта работа была поддержана Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (1R01NS076794-01, для T.T.), премией Zenith Fellows Award Ассоциации Альцгеймера (ZEN-10-174633, для T.T.) и премией Джули Мартин за середину карьеры в исследованиях старения Американской федерации исследований старения / Медицинского фонд....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ИзофлуранAbbottNDC 0044-5260-05
Ножницы для препарированияVWR82027-582
Ножницы для препарирования Тупой наконечникVWR82027-588
ПинцетVWR94024-408
Игла 23 G ИглаVWRBD305145
перистальтический насос FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02Фосфатно-солевой буфер; Рабочая концентрация 1x
Матрица мозга взрослой мыши, Корональные срезы, Нержавеющая сталь 1 мм Kent ScientificRBMS-200C
Матрица мозга взрослой крысы, корональные срезы, нержавеющая сталь 1 мм Kent ScientificRBMS-305C 
32% параформальдегидный водный раствор (PFA)EMS15714-SВнимание: Токсичный. Рабочая концентрация: 4% в PBS
ЭтанолVWR89125-188Различные концентрации, см. протокол
Tissue-Tek Uni-кассеты SakuraVWR25608-774
Встраивание и инфильтрация ПарафинVWR15147-839
Микротом Leica RM2125Leica Biosystems
Одноразовые лезвия для микротом VWR25608-964
Водяная баня Leica HI 1210Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plusVWR48311-703
XyleneSigma-Aldrich534056-4X4LВнимание: Токсично 
Раствор для извлечения мишени 10xDAKO S1699Рабочая концентрация 1x
KimWipesVWR21905-026
Гидрофобная ручка PAPVWR95025-252
Triton X-100VWR97062-208
Нормальная ослиная сыворотка (NDS)Jackson Immuno017-000-121
CoverslipsVWR48393081
Пролонгируйте золотой реагент против выцветания с DAPILife TechnologiesP36935
Glass Slide RackVWR100492-942
Антитело Iba1 (поликлональное, кроличье)Wako019-19741 Рабочая концентрация 1:200
Антитело Iba1 (поликлональное, козьеLifeSpan BioscienceLS-B2645Рабочая концентрация 1:200
антитело CD68 [KP1] у крысы (моноклональное, мышиное)Abcamab955Рабочая концентрация 1:200
антитело к CD68 [FA-11] мыши (моноклональное, крысиное)Abcamab53444Рабочая концентрация 1:200
антитело к CD107a (LAMP1) мыши (моноклональное, крысиное)Affymetrix14-1071Рабочая концентрация 1:100
Бета-амилоид, 17 - 24 (4G8) антитело (моноклональное, мышиное)CovanceSIG-39220Рабочая концентрация 1:200
Бета-амилоид, 1 - 16 (6E10) антитело (моноклональное, мышиное)CovanceSIG-39320Рабочая концентрация 1:200
OC антитело (поликлональное, кроличье)Подарено Д. Х. Криббсом и К. Г. Глэйбом (Калифорнийский университет в Ирвайне)Рабочая концентрация 1:200
Alexa Fluor 488 мышиное вторичное антителоInvitrogenA-11001Рабочая концентрация 1:1,000
Alexa Fluor 488 крысиное вторичное антителоInvitrogenA-11006Рабочая концентрация 1:1,000
Alexa Fluor 594 вторичное антитело кроликаInvitrogenA-11037Рабочая концентрация 1:1,000
Alexa Fluor 594 козье вторичное антителоInvitrogenA-11080Рабочая концентрация 1:1,000
Alexa Fluor 647 Мышиное вторичное антителоInvitrogenA-21235Рабочая концентрация 1:1,000
Alexa Fluor 647 вторичное антитело кроликаInvitrogenA-21443Рабочая концентрация 1:1,000
Иммерсионное маслоNikon 
Конфокальный микроскоп А1Nikon 
Программное обеспечение для перспективных исследований NIS ElementsNikon 
Imaris:Используется программное обеспечение Bitplane версии 7.6Bitplane"coloc" и "supass".  В качестве альтернативы, бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом  ImageJ может быть использован для колокализации  Анализ конфокальных наборов данных Z-стеков.
) Используются модули

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., G....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Quantitative 3D In Silico ModelingAmyloid beta PhagocytosisMononuclear PhagocytesConfocal MicroscopyColocalization Analysis3D ReconstructionPhagolysosome StainingRodent Alzheimer ModelsFluorescent ImmunostainingCerebral Amyloid beta

Related Articles